第六章动物实验设计.

第六章动物实验设计主要内容动物实验设计的基本原则动物实验设计和实施的基本过程实验动物的选择动物实验设计的意义正确的动物实验设计对提高科学研究质量、发表高水平的学术论文非常重要目前许多动物实验质量不高，低级别动物给实验结果的科学性带来影响一个好的实验设计，可以使问题变得更加容易解决一个不正确的实验设计，导致结果信息无用。动物实验的分类探索性的实验：从事开创性的研究工作时，为探寻未知事物或现象的性质以及规律所进行的实践活动。为产生新的假说提供素材。验证性的实验：验证性实验是指对研究对象有了一定了解,并形成了一定认识或提出了某种假说,为验证这种认识或假说是否正确而进行的一种实验。强调实验操作和观察。收集有关处理实施后动物反应的科学数据。•这两类实验都涉及在实验人员控制下对动物施加一定的处理或操作，来发现是否处理在实验对象上引起一定的反应，或者对这种反应进行定量。检验性实验：是观察性的实验，用于发现科研人员不能控制的变量之间的联系。这种联系可能是暂时的也可能是长期的。一、实验设计的基本原则创新性和先进性；科学性和重复性；易行性和可控性；经济性和有用性；常用的动物实验设计类型完全随机化设计（简单随机抽样）配对设计完全随机化设计随机分组：先将动物按顺序编号，再用随机化工具，将动物分组，分为实验组和对照组。优点：方法简单，容易操作，灵活，统计分析也比较简单，信息损失较小。缺点：对非实验因素缺乏有效控制，只能靠随机化方法平衡有关因素的影响。结果精确度降低，误差往往偏高。所以一般适用于实验对象同质较好的实验设计。配对设计实验动物个体之间的差异较大时，可采用配对设计。选择个体差异较小的动物配成对，然后随机分配给处理组和对照组。主要用于封闭群大型实验动物，如狗、猫、猴，个体差异大，不易获得较大数量的相似个体，一般采用配对设计。科研工作基本程序提出假说、确定题目安排实验、验证假说数据处理、完成论文具体工作程序提出问题专业和统计学设计预实验正式实验数据处理统计分析实验设计实验观察实验结果确定题目分析结果做出结论调整设计写出论文动物实验设计的内容和步骤在观察记录实验相关信息并进行分析和归类的基础上提出假设——观察到的现象和可能发生的现象之间关系的推测明确研究焦点明确方法明确模型评估实验选择合适的动物和动物模型实验方法的选择人员，实验花费给药方法风险评估统计学方法选定1、选择研究题目（What，Why）查阅文献明确研究目标提出问题：实验将说明的问题是什么，意义二、动物实验的设计及实施过程2、提出假说假说提出的一般过程：1、观察和记录所有相关的信息（包括研究者已开展的初步实验结果）2、分析和归类这些信息3、在这些信息的基础上提出假说假说是实验研究设计的前提，如果没有假说，实验和观察就失去目标。假说关系着实验研究的目的性、计划性和预见性。对假说既应努力加以验证，又应适时加以抛弃，重新建立新的假说，再加以验证。这样才有可能使正确的假说上升为结论、原理和学说。研究者开展动物实验前，应在熟悉有关实验动物理论知识和动物实验技能的基础上，积极进行逻辑思维，结合实际条件，提出创新性课题和大胆的假说。3、动物模型的确定使用系统发育水平最低的动物，符合３Ｒ原则使用的动物具有研究要求种属或品系专一特点，特定研究目的必须特点实验期间动物模型维持条件动物模型来源渠道4、实验合作者的确定在研究的过程中，明确应用的试验技术操作，并确认具有相应操作专长的人员来完成。让合作者了解实验：设计、计算、样品收集．5、研究方案根据问题、目标、假说，提出实验操作安排的计划并文字化。A：动物模型持续时间B:模型中预期疾病的进程（决定测定的最适时间点）Ｃ：人员参加的时间，实验花费Ｄ：给药方法Ｅ：风险评估Ｆ：统计学方法选定6、对照的设置对照：过多的变量（如遗传、环境、感染因子）对动物试验的结果产生影响，因此为消除这些外来变量或可能存在的未知变量的影响而设置对照动物。对照种类：阳性对照阴性对照空白对照媒介物对照比拟物对照阳性对照：一般在阳性对照组希望有变化作用：作为一个标准，测量各实验组间差异的程度；检查工作体系的可行性；例如：毒物试验，动物给予毒物作为对照，结果是产生损伤或变化，结果可重复，说明动物对毒素的反应是可检测的。PCR实验：加含有目的基因的序列，其余与实验组一致，应扩增出条带阴性对照：期望有正常状态不产生变化作用：保证未知变量对实验组动物引起相反的效应不存在，即排除假阳性毒素实验：不给于毒素处理，一般用生理盐水或PBS缓冲液替代PCR：不含模板，一般加水做替代，不应扩增出条带空白对照模拟处理组的过程而实际上没有给予动物以受试物或处理。例如：假手术，因为有些处理可引起动物的反应，如应激反应，为了消除组间差异，需要做相同的处理媒介物对照在测试化合物溶于一种媒介时，这种媒介需要对照作用：与非处理组对比，观察溶剂是否引起反应比拟物对照与阳性对照性质一样，使用一个已知的处理来对比待测的处理例如：药物治疗，使用一种已知的公认的临床药物，对比实验药物，来确定新药是否有作用。7、动物实验的样本量样本量既要满足有效性的需要，又要符合法规对数量的限制样本含量（样本大小）与精确度有关，样本含量越大，精确度越高。但是会增加成本。样本含量与置信概率有关，样本含量越大，置信概率越高。要求抽样误差小的，样本含量要大些。样本含量：抽样研究中主要参数。要求明确总体的同质范围，有足够的代表性，遵循随机抽样，有足够的观察单位数。精确度：从抽取样本的结果来推测总体的结果概率抽样误差：由于随机抽样所造成的样本统计量与总体参数的差异；特点是由于个体差异引起，不可避免的，抽样误差可以控制并有一定的规律性。置信概率：习惯上，将P≤0.05或≤0.01的事件称为小概率事件，表示某事件发生的可能性很小。那么置信区间为95%或99%样本量计算n=2σ2(tα+tβ)2/δ2n：样本数σ：标准差tα：α=0.05时的t分布值，tα=1.96。tβ：无显著性的分布值，tβ=0.8421-β：实验检验能力，一般为80%，1-80%不能计算样本量的情况探索性实验——前期信息缺乏或成功与否不确定•例如转基因动物的制作需要大量动物•基因片段整合率•移植后受精卵着床率•DNA注入而造成的损伤可使许多受精卵在中途停止发育•随机整合，基因表达与整合位置和拷贝数相关不能计算样本量时可先做小规模预实验位正式实验提供样本量依据•例如：研究X因子在炎症小鼠中升高情况•可先用10只小鼠预实验，分别在诱发炎症前后测定X因子浓度，如果得到的数据标准差较小，再如果诱发炎症后X因子浓度增加了2倍（明显提高），说明X因子的变化很容易检测出来，继续实验得到阳性结果的可能性非常大8、实验动物的分组动物实验时必须把动物随机分配到实验各组，以确保研究的变量在每一组中不会导致偏差数据。必须在选择的时候选定同源的动物群体，生物学特性一致的动物方法:A：每一只动物一个编号，1第一组，2第二组………暗箱抽取B:动物多可以利用数字随机或计算机程序随机9、人员及法规必须有相关培训人员才能承担实验我国由省级科技主管部门进行培训实验开始前必须通过IACUC和实验动物伦理委员会的确认。包括动物饲养管理和使用的具体操作方法按照相关法律提供申请书时，需要相关证明实验涉及到危险品，还需要其他委员会的批准10、讨论实验设计完成后广泛征求意见。很重要！！动物实验设计的内容和步骤11、小规模的预实验小规模的预实验是使用少量的动物得到预示性的数据或通过预实将操作和技术固定并完善，以便于进行大规模的正式实验通过预实验确定实验动物用量证明实验合理性预实验同样需要经过IACUC同意12、验证假说的正式实验大多数实验属于检验一个假说的正式实验，一般实验都可以得到一些有用的信息，至少重复三次。13、确定检验的假说假说可以简单的归结成一个或几个问题，两组或几组数据的比较组间差异越小，观察到显著性差异的样本量肯定越大14、实验数据的收集和整理实验数据的记录•详细：包括动物实验数据、试剂、实验环境条件•原始记录•精确、准确•便于归类和分析-----记录表一实验记录的主要内容项目名称实验目的研究内容实验日期实验条件参考文献实验材料实验设计原理和方法实验过程实验结果实验讨论及记录者签名34数据保存•除原始记录外，原始数据需录入计算机保存•录入格式便于统计分析•录入后需要核对——准确性和真实性核查实验数据的统计描述1、算术平均数：表示一组观察值（或变量）的集中趋势、中心位置或平均水平的指标。2、标准差：表示一组变量值离散程度（dispersion）的指标，均数与标准差结合能更全面地说明一组变量的分布情况。3、率：表示一定条件下某种现象实际发生数与可能发生数的比。4、构成比：又称构成指标，表示事务或现象内部各构部分的比重。常称百分比。动物实验数据的统计处理T检验•一种常用的对计量资料（记数资料）进行假设检验的统计方法•主要检验两组均值之间的比较方差分析•方差也称均方，是标准差的平方，是表示组内个体间或各组间发生变异的量；•组间均方表示均数间（实际上是组间）的变异程度；组内均方表示组内个体的变异程度，也称误差论文中动物实验的描述品种、品系的名称微生物质量来源合格证号性别年龄体重数量实验和饲养环境动物实验处理方式三、实验动物的选择实验动物种类众多，如何依据不同的实验目的来正确地选择动物，是作好一项研究工作的第一步严格地说，实验动物选择的正确与否，不仅影响到经费支出、工作进展，还会影响到实验结果的正确性与可靠性，以及整个实验的顺利完成。美国科研中所用动物选择内容动物品种品系年龄与体重性别生理与健康状况动物实验结果分析StrainofbreedAge&WeightSexPhysiologicalcharacter&HealthAnalysisofexperimentalresults动物品种品系同物种内的不同品种、品系，由于生物学特性的差异，对相同试验反应结果存在差异。同品系的各亚系之间差异可相当于不同品系。•DBA小鼠会发生听源性癫痫发作，而C57BL小鼠根本不出现这种反应。•BALB/cAnN小鼠对放射线极敏感，而C57BL/CdJN小鼠对放射线却有抵抗力•C57BL小鼠对肾上腺皮质激素的敏感性比DBA小鼠高12倍•DBA小鼠对雌激素较C57BL小鼠敏感动物的年龄和体重实验动物的机体反应性随年龄而有所变化。幼年动物往往较成年动物敏感，而老年动物代谢功能降低，反应不灵敏•成年动物—大多数实验都选择•老年动物—多用于老年医学研究中•幼年动物—慢性实验或长期毒性实验（实验周期长）动物的体重年龄与体重一般呈正相关性。同一实验中，动物的体重应尽可能一致，一般不应相关10%，若相差悬殊，则易增加动物反应的个体差异，影响实验结果的正确性动物的性别许多实验证明，不同性别的动物对同一药物的敏感性差异较大，对各种刺激的反应也不尽一致，雌性动物在性周期不同阶段和怀孕、哺乳时的机体反应性有较大的改变，因此科研工作汇总一般选择雌雄各半进行试验药物反应中性别不同效果尤为不同。例如：5-6周的雄性大鼠给药角新碱，可见镇痛效果，但是雌性则没有镇痛效果。生理与健康状况生理状态•实验动物处在特殊的生理状态如怀孕、哺乳时，其体重及某些生理生化指标将有所不同，对外界环境因素作用的反应亦与非怀孕、非哺乳的实验动物有着较大差异功能状态•患病动物对药物的耐受性较健康动物小，因而患病动物容易在实验过程中中毒死亡动物实验结果分析进行动物试验研究时，一定要对可能的研究结果进行充分的分析论证。因为动物实验的结果或结论，根据对应原则，最终将主要应用于人类疾病研究中。在肯定一个实验结果时，最好采用两种以上动物进行比较观察（啮齿类、非啮齿类）常用顺序：小鼠、大鼠、狗或猴实验动物选择基本原则可靠性原则相似性原则重复性原则可控性原则经济性原则1、可靠性原则根据课题研究的目的、内容、水平，选用相匹配的标准化动物：遗传背景明确，具有已知菌丛和模型性状显著且稳定的动物；质量合格证：动物级别、合格证编号等单据复制的动物模型来应该力求可靠地反映人类疾病，即可特异地、可靠地反