虎奶菇液体发酵条件的研究

1虎奶菇液体发酵条件的研究陈济琛*林戎斌林陈强蔡海松郑永标林新坚（福建省农业科学院土壤肥料研究所，福建福州350013）摘要：采用液体摇瓶培养，对虎奶菇（Pleurotustuber-regium）液体发酵条件进行初步研究，通过L9（34）正交试验，筛选出最佳的培养基组合。结果表明，虎奶菇液体发酵适宜的培养条件：温度28~32℃，培养基起始pH6.0，250ml摇瓶装量100ml，转速120~160r/min，培养时间8d；适宜的培养基：黄豆粉1.5%，葡萄糖3%、酵母粉0.1%、磷酸二氢钾0.1%，葡萄糖是影响菌丝体生长的主要因子。关键词：虎奶菇，液体发酵，菌丝体虎奶菇是一种尚未开发的珍稀药用菌，产于亚洲热带地区﹑澳大利亚和非洲，中国主要分布在云南省的腾冲﹑章凤等地。菌物学家鉴定，虎奶菇隶属担子菌亚门﹑层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属（平菇属），学名为Pleurotustuber-regium（Fr.）Sing（1951年）。据报道虎奶菇富含蛋白质、多糖等活性物质和钾、钙、镁等矿质元素,具有较高的营养价值和药用价值。非洲一些国家用虎奶菇治疗胃病、糖尿病、冠心病、高血压等疾病，南洋各国用虎奶菇菌核治疗痢疾。虎奶菇菌核入药，外敷有治疗妇女乳腺炎之效。利用液体发酵技术生产食用菌菌丝体并开发相关产品已得广泛应用。关于虎奶菇液体发酵的报道却很少，对此我们在引种栽培虎奶菇之后对其液体发酵进行深入研究，现将结果报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株：虎奶菇（Pleurotustuber-regium）引自福建三明真菌研究所。1.1.2斜面培养基：PDA综合培养基。1.1.3液体培养基：黄豆粉1%、葡萄糖2%，pH自然。黄豆粉煮30min，4800r/min离心30min。1.2方法1.2.1接种与培养：250ml三角瓶装100ml液体培养基，接种斜面菌种1cm2两块，置30℃、160r／min摇床培养7ｄ，得到一级种。取菌球研磨破碎后，加入60ml无菌水振荡均匀，按1%接种量接入液体培养基，培养7ｄ后收集菌丝体。1.2.2液体发酵条件确定：250ml三角瓶装液体培养基，按培养温度20℃、24℃、28℃、20℃、32℃、36℃、40℃，起始pH３、4、5、6、7、8、9，摇瓶装量60、80、100、120、140ml，摇床转速80、120、160、200、240r/min，接种量1%、2%、5%、10%、15%，分５组进行，５个重复。1.2.3菌丝干重的测定：发酵液经60目筛过滤，收集菌丝体，60℃烘干至恒重。以每100ml发酵液中菌丝体干重（mg/100ml）计。1.2.4L9（34）正交试验：根据前期碳氮源单因素试验的结果，选择最佳的氮源黄豆粉、碳源葡萄糖，促生长因子酵母粉、无机盐及pH调节因子磷酸二氢钾，按L9（34）设计四因素三水平试验，9个组合，5个重复。试验因素和水平见表1。基金项目：福建省自然科学基金项目（B0310024）*作者简介：陈济琛（1964-），男，副研究员。研究方向：农业微生物与食用菌。2表1试验因子及水平Table1Factorsandlevelsofthetrial水平黄豆粉A葡萄糖B酵母粉C磷酸二氢钾D10.51.00.10.121.02.00.20.231.53.00.30.32结果与讨论2.1培养温度对菌丝产量的影响表2结果表明，培养温度从20℃升至28℃的过程中，菌丝产量不断增加，28℃菌丝产量达最高值1067mg/100ml。28℃至32℃菌丝产量相对稳定，差异不显著。36℃培养菌丝产量急速下降，40℃菌丝停止生长。可见虎奶菇最佳的培养温度为28℃~32℃。表2温度对菌丝产量的影响Table2Effectsoftemperatureonthemyceliayield温度菌丝产量差异显著性℃（mg/100ml）0.050.01400aA36216+65.2bB20453+40.4cC24966+22.7dD321023+18.7eDE281067+57.3eE注:*数据为5重复的平均值±标准差，小写字母不同表示差异显著（P﹤0.05），大写字母不同表示差异极显著（P﹤0.01），下文同。2.2起始pH对菌丝产量的影响由于葡萄糖在高温过程中产酸，pH难以控制，本试验葡萄糖用甘露醇替代，培养液高压灭菌后用NaOH和HCl调成不同的pH。从表3结果看出，pH从３升至６，菌丝产量不断增加，pH６时菌丝产量达最高值，pH７之后菌丝产量逐渐下降。试验说明虎奶菇较适合在pH６中性偏酸的环境生长，该值与培养基自然pH６.5相近。表3pH对菌丝产量的影响Table3EffectsofpHvalueonthemyceliayieldpH菌丝产量差异显著性（mg/100ml）0.050.0130aA4622+22.4bB9710+33.0cC5732+18.1cC8808+72.4dD7910+63.7eE61048+41.8fF2.3摇瓶装量对菌丝产量的影响在250ml摇瓶装入不同量的培养液，培养发现装量从60ml至140ml，菌丝产量差异不显著，说明虎奶菇对溶氧要求不高。其中装量100ml时，菌丝产量相对较高，可作为虎奶菇液体发酵的装瓶量。3表4摇瓶装量对菌丝产量的影响Table4Effectsofliquidvolumeonthemyceliayield装量菌丝产量差异显著性（ml）（mg/100ml）0.050.011201022±61.5aA1401026±41.0aA601032±35.7aA801044±42.5aA1001126±25.4aA2.4摇床转速对菌丝产量的影响摇床转速影响通气量的大小，从而影响菌丝体生长。试验结果表明，转速在120r/min~160r/min菌丝产量最高,转速高于160r/min和低于120r/min时菌丝产量都有显著下降。可见转速太低或太高都不利于菌丝体生长，虎奶菇液体发酵最佳的转速为120r/min~160r/min。表5转速对菌丝产量的影响Table5Effectsofshakefrequencyonthemyceliayield转速菌丝产量差异显著性（r/min）（mg/100ml）0.050.0180384.40±64.7aA240985.60±57.1bB2001007.40±61.9bB1601167.20±27.7CC1201212.40±43.0CC2.5接种量对菌丝产量的影响随着接种量从1%到10%的增加,菌丝产量有小幅增加，接种量增至15%时，菌丝产量略有下降，但都达不到差异极显著水平，表明接种量对菌丝产量的影响较小。虎奶菇液体发酵接种量可选2%~10%,菌丝产量较高。表6接种量对菌丝产量的影响Table6Effectsofinoculationamountonthemyceliayield接种量菌丝产量差异显著性（%）（mg/100ml）0.050.01151120±39.2*aA11120±38.2aA21129±27.7abA51149±32.1abA101168±29.1bA2.6培养时间对菌丝产量的影响表7结果可以看出，培养初期随着时间的延长，菌丝产量迅速增长，第８ｄ达到最大值，每100ml发酵液中菌丝产量为1204mg。继续培养时菌丝产量缓慢下降，第１２ｄ和１６ｄ菌丝产量有较大的降幅，说明菌丝体开始老化自溶。第６ｄ，８ｄ和10ｄ的菌丝产量差异不显著，因而确定虎奶菇液体发酵菌丝采收的最佳时间是６~10d。4表7培养时间对菌丝产量的影响Table7Effectsofculturetimeonthemyceliayield2.7培养基的优化虎奶菇培养基正交实验结果见表8。表8虎奶菇正交实验结果的极差分析Table8Resultsandanalysesoftheorthogonaltrialineachgroup实验号黄豆粉A葡萄糖B酵母粉C磷酸二氢钾D菌丝产量(mg/100ml)1111168021222944313338044212381352231116862312177873132858832131485933211818K12428235139433666K23759359735753580K34161440028303102R173320491113564极差分析表明，各因素对虎奶菇菌丝产量的影响程度为BACD。葡萄糖是影响菌丝产量的主要因子，其次是黄豆粉和酵母粉，磷酸二氢钾影响最小。四因素最佳组合为A3B3C1D1，即虎奶菇适宜的培养基：黄豆粉1.5%，葡萄糖3%、酵母粉0.1%、磷酸二氢钾0.1%。葡萄糖是影响虎奶菇菌丝体生长的主要因子。参考文献[1]黄年来，郭美英，黄黎红，1997．虎奶菇及其栽培．中国食用菌，16(1)：13～15[2]裘娟萍，孙培龙，朱家荣，钟卫鸿，2000．灰树花深层发酵培养基的研究．微生物学通报，27(4)：275～278时间菌丝产量差异显著性（day）（mg/100ml）0.050.0100aA298±bB16904±cC141068±61.7dD41078±27.7dD121080±70.3dD101166±25.4eE61195±41.3eE81204±14.7eE5[3]杨淑云，刘朝贵，朱凯，邓春，2003．富硒姬松茸液体培养条件的研究．微生物学通报，30(1)：9～13[4]林戎斌，陈济琛，林新坚．虎奶菇引种栽培试验．食用菌，2001，23(2)：15～15[5]宫志远，于淑芳，曲玲，高爱华，2002．pH对五种珍稀食用菌菌丝生长的影响．食用菌学报，9(1)：40～43StudiesonLiquidCultureConditionsofPleurotustuber-regiumCHENJi-chenLINRong-binLINChen-qiangCaiHai-songZHENGYong-biaoLINXin-jian（SoilandFertilizerInstitute,FujianAcademyofAgricultualSciences,FuzhouFujian350013）Abstract:TheconditionsofPleurotustuber-regiuminsubmergedculturewithshakeflaskwerestudiedbyorthogonalexperiments(L9（34）)inthispaper.Theresultsindicatedthattheoptimalcultureconditionscouldbeasfollow:28～32℃,pH6.0,250mlconicalbottlecontainedwith100ml，120~160r/minand8daysofculturalperiod,andtheoptimalmediumcouldbeasfollow:beanpowder1.5%,glucose3%,yeastpowder0.1%andKH2PO40.1%.ThemajorfactorofinfluencingthemyceliumgrowthofPleurotustuber-regiumwasglucose.Keywords:Pleurotustuber-regium，liquidculture，mycelium