蛋白电泳标准操作规程

SDS-PAGE凝胶电泳常用试剂：30%Acy2gN,N-双丙烯酰胺R-250染色液1gR-25058g丙烯酰胺250ml异丙醇146ml水100ml冰醋酸650ml水1.0MTris-HCL(PH6.8)12.11gTris1.5MTris-HCL(PH8.8)36.34gTris加80ml水加160ml水调PH至6.8调PH至8.8定容至100ml定容至200ml5﹡Tris-GlycineBuffer15.1gTris5﹡SDS-LoadingBuffer1.25ml1.0MTris-HCL(PH6.8)94gGly0.5gSDS5gSDS25mgBPB930ml水2.5ml甘油定容至5ml脱色液150ml冰醋酸50ml无水乙醇850ml水1.1操作步骤3.2.1SDS-PAGE凝胶电泳操作步骤㈠SDS-PAGE凝胶的灌制1.根据厂家说明书安装玻璃板2.确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物使之充分混匀，并进入下步操作。配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液各种组分名称各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量5ml10ml15ml20ml25ml30ml3.迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm）。再在胶液面上小心注入一层水（约1-2cm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。4.分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。5.制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物使之充分混匀，并进入下步操作。配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%浓缩胶溶液各种组分名称各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量3ml4ml5ml6ml8ml水2.1ml2.7ml3.4ml4.1ml5.5ml30%丙烯酰胺(Acy)0.5ml0.67ml0.83ml1.0ml1.3ml1MTris-HCL(PH6.8)0.38ml0.5ml0.63ml0.75ml1.0ml10%SDS0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08ml10%过硫酸铵(AP)0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08ml10%Gel水1.9ml4.0ml5.9ml7.9ml9.9ml11.9ml30%丙烯酰胺(Acy)1.7ml3.3ml5.0ml6.7ml8.3ml10.0ml1.5MTris-HCL(PH8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10%SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸铵(AP)0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml15%Gel水1.1ml2.3ml3.4ml4.6ml5.7ml6.9ml30%丙烯酰胺(Acy)2.5ml5.0ml7.5ml10.0ml12.5ml15.0ml1.5MTris-HCL(PH8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10%SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸铵(AP)0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012mlTEMED0.003ml0.004ml0.005ml0.006ml0.008ml6.聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，将凝胶垂直放置于室温下。7.样品的处理：在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按等比例加入样品处理液（即）100℃加热5min以使蛋白质变性。8.浓缩胶聚合完全后（约30min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。9.按预定的顺序进行加样，加样量通常为10—20微升。10.将电泳装置与电源相接，浓缩胶一般用低压100V，当样品进入分离胶界面时调节电压至145V，继续电泳直至样品达到分离胶底部上方约1cm处，然后关闭电源。11.从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。㈡SDS-PAGE凝胶的染色用考马斯亮蓝对SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行染色（一般加热2-3min，再放到摇床摇5-10min来加速它的染色）㈢SDS-PAGE凝胶的脱色将染色后的凝胶取出放置在大烧杯中，倒入脱色液进行脱色（一般加热2-3min，再放到摇床摇2-3h来加速它的脱色或在摇床上脱色过夜）脱色后，将凝胶取出浸于水中，为永久性记录结果，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。3.3整个蛋白免疫印迹杂交实验完成，整理实验仪器，并填写相应的记录。