蛋白酶的测定方法

响应面法优化蛋白酶生产工艺（下）实验内容1、干物质失重的测定2、蛋白酶活力的测定3、数据分析与建模4、响应曲面作图5、整改方案分析一、干物质失重的测定干重失重＝发酵前干重－发酵后干重二、蛋白酶活力分析1、原理（1）、福林试剂在碱性情况下极不稳定，可被酚类化合物还原而呈蓝色反应。（2）、蛋白质分子中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸及苯丙氦酸等)。（3）、以酪蛋白为底物，同酶液反应，经一定时间后，加三氯醋酸，终止酶反应，并使残余的酪蛋白质沉淀，同水解产物分开，经过滤后取滤液。用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色，用分光光度计测定。（4）、蓝色反应的强弱，同蛋白水解产物的多少成正比而水解产物的量又是同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可推测蛋白酶的活力。2试剂1福林试剂于2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g，钼酸钠(NaMoO4·2H2O)25g，水700ml，85%磷酸50m1，浓盐酸1000ml，文火回流10h．加入硫酸锂(Li2SO4)150g，蒸溜水50m1，混匀取去冷凝器，加入几滴液体溴，再煮沸l5min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷却后，定溶至1000ml。过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成稀释的福林试剂。2、0.4mol/L三氯醋酸(TCA)溶液称取三氯醋酸65.4g，定容至1000ml。3、0.4mol/L碳酸钠溶液称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，定容至1000m1。4、0.05mol/LpH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液A液：称取10.6g80-90%乳酸加蒸馏水定容至1000ml。B液：称取16克70%乳酸钠加蒸馏水定容至1000ml。取A液16ml与B液1ml稀释1倍即成0.05mol/LpH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液。5、2%酪蛋白溶液称取干酪素2g加入0.1mol/L氢氧化钠20ml在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液定容至1000ml即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存。否则极易繁殖细菌，引起变质。配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加1~2滴酒精消泡。3350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，应加弄乳酸2~3滴湿润。6、100μg/m1酪氨酸溶液精确称取在l05℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.1mol/L盐酸(HCl)使溶解，加蒸溜水定容至100m1，其浓度为1000μg/m1。再吸取此液10ml以蒸馏水定容至100ml即配成100μg/m1酪氨酸镕液．此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。3操作步骤3.1标准曲线的绘制（1）按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(2)测定步骤另取6支试管按上表编号分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0.4mo1/L碳酸钠5m1，再加入已稀释的福林试剂1m1。摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min，在波长660nm处测定吸光度。一般测3次，取平均值．以吸光度为纵座标，酪氨酸的浓度为横座标，绘制成标准曲线。准确称取蛋白酶固态发酵的湿曲2g，用10－20ml蒸馏水，30℃浸提半小时，用滤纸过滤。将滤液稀释一定倍数(使其测定光密度在0.2－0.4范围内为宜)。3.2酶液的制备取四支试管，分别加入1ml稀释酶液，其中一支为空白管，三支为平行试验管，置入40℃水浴中预热3－5min。在三支平行试验管中分别加入1ml2%酪蛋白溶液，准确计时保温10min。立即加入2ml0.4M三氯乙酸溶液，l5min后用滤纸过滤。分别吸取1ml清液，加5ml0.4M碳酸钠溶液，最后加入1ml福林-酚试剂，摇匀，于40℃水浴中显色20min。空白管中先加入2ml0.4M三氯乙酸溶液，再加lml2%酪蛋白溶液，15min后用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。以空白管为对照，在680纳米波长下测光密度，取其平均值。3.3测定蛋白酶活力单位定义：在40℃，pH2.5下，每分钟水解酪蛋白释放1微克酪氨酸的酶量定义为1个蛋白酶单位。式中：K：标准曲线中O·D值为1所相当的酪氨酸的微克数；OD：平行试验管的平均光密度；4：试管中反应液总体积(毫升)；10：反应10分钟；N：稀释倍数；W：曲的称取量(克)4计算（1）对于同一台分光光度计与同一批福林-酚试剂，其工作曲线K值可以沿用，当另配福林-酚试剂时，工作曲线应重作。（2）当用不同产品的酪蛋白对同一蛋白酶测定时，其结果会有差异，故蛋白酶活力表示时应注明所用酪蛋白的生产厂。5说明三、数据分析与建模使用DESIGNEXPERT7.1软件1、建立数学模型2、模型显著性检验3、解方程，求出最佳发酵条件4、求出模型所预测的最高产量。四、响应曲面作图Design-Expert?SoftwareR155.328.8X1=A:AX2=B:BActualFactorC:C=65.001.081.291.501.711.920.020.060.100.140.183242526272Freegossypol(μg/g)(NH4)2SO4(%)KH2PO4(%)作出本次实验的2D与3D曲面图。五、整改方案分析分析本次实验设计存在的问题，如何改进实验设计？