蛙心离体灌流活动的影响因素分析

蛙心离体灌流活动的影响因素分析摘要：通过对蛙类离体心脏进行人工灌流实验，学习蛙类心脏暴露与离体的方法、斯氏蛙心插管法与灌流法以及计算机采集系统和张力传感器的使用方法，熟悉心脏的结构，研究心脏活动的规律及特点，并通过记录与观察心搏曲线的变化来了解灌流液成分的改变（即Na+、Ca2+、K+、肾上腺素、乙酰胆碱）对蛙类离体心脏活动的影响。结果表明：心脏具有自动节律性和收缩性。当任氏液中加入Ca2+或肾上腺素（Adr）后，心搏曲线的基线上移，即对蛙类离体心脏的收缩机起到了促进作用；而当任氏液中加入Na+、K+或乙酰胆碱（ACh）后，心搏曲线的基线下移，即对蛙类离体心脏的收缩机起到了抑制作用。关键词：Na+；Ca2+；K+；肾上腺素；乙酰胆碱；心搏节律蛙类，属于两栖纲，无尾目，品种甚多，是脊椎动物由水生向陆生过渡的中间类型。蛙类虽然较为低等，但在生理学实验中应用非常广泛，其循环系统、神经系统以及肌肉均为生理学常用的实验材料。诸如离体心脏灌流、下肢血管灌流、微循环的观察、心电图；脊髓休克、脊髓反射、谢切诺夫抑制、反射弧的分析实验以及坐骨神经-缝匠肌、腹直肌等均为生理学的重要实验的标本。心脏具有自动产生节律性收缩的特性，即自动节律性。因此，在心脏离体后，，如用人工灌流方法，可保证其新陈代谢的顺利进行，但心脏仍能有节律地自动收缩和舒张，并可维持较长的时间。离体心脏活动所需的条件应与动物内环境的理化性质保持基本相近，因此改变灌流液的理化因素，则可引起心脏活动的变化。故可以采用离体心脏灌流的方法来研究心脏活动的规律、特点及影响因素。1材料和方法1.1材料实验材料：活体蛙或蟾蜍（取自水产品市场）。实验用具：蛙心套管（斯氏套管或八木氏套管）、套管夹、支架、双凹夹、滑轮、烧杯、常用手术器械、蛙板（或蜡盘）、蛙心夹、计算机采集系统、张力传感器、滴管、培养皿（或小烧杯）、污物缸、纱布、棉线、橡皮泥、任氏液、0.65%NaCl、2%CaCl2、1%KCl、1：5000肾上腺素、1：10000乙酰胆碱、300U/ml肝素。1.2方法1.2.1仪器的准备打开计算机采集系统、接通张力传感器输入通道。从显示器的“设置”菜单，弹出“设计实验标记”对话框，选择“蛙心灌流”后，再从“实验项目”的“循环实验”中，选定“蛙心灌流”实验（用以标记实验）。所用仪器若无此设置，可以用通用标记作实验标记。1.2.2离体蛙心的制备蛙心的暴露：取一只蛙或蟾蜍，双毁髓后背部置于蛙板中，一手持手术镊提起胸骨后方的皮肤，另一只手持金冠剪剪开一个小口，然后将剪刀由开口处伸入皮下，向左、右两侧下颌角方向剪开皮肤。将皮肤掀向头端，再用手术镊提起胸骨后方的腹肌，在腹肌上剪一口，将金冠剪紧贴体壁向前伸入（注意勿伤及心脏和血管），并沿皮肤切口方向剪开体壁，剪断左右乌喙骨和锁骨，使创口呈一倒三角形。然后，一手持眼科镊，提起心包膜，另一只手用眼科剪剪开心包膜，暴露心脏。斯氏蛙心插管法：如下图所示，仔细识别心脏周围的大血管，在左主动脉下方穿一线，于动脉圆锥处结扎（动物个体小时，结扎位置可靠上些），再从左右两主动脉下方穿一线，并打一活结备用。左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉上壁剪一斜口，选择大小适宜的蛙心套管，然后将盛有少量（套管内2~3cm高度）任氏液（内加入一滴肝素溶液）的斯氏蛙心套管，由开口处插入动脉圆锥内。当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，经主动脉瓣插入心室腔内（于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管下口）。此时可见套管中血液冲出套管，并使液面随心脏搏动而上下移动，表明操作成功（否则需退回并重新插入）。用滴管吸去套管中的血液，更换新鲜的任氏液。稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧（不得漏液），再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体（切勿损伤静脉窦）。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内液面高度一致，即可进行实验。图示：蛙心插管法1.2.3离体蛙心与张力传感器的连接将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖肌肉（不可夹得过多，以免因夹破心室而漏液）。再将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。注意：勿使灌流液滴到传感器上。调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。1.2.4改变灌流液成分对蛙类离体心脏活动影响的记录1.2.4.1记录正常心搏曲线1.2.4.2记录改用0.65%NaCl溶液的心搏曲线改用0.65%NaCl溶液灌流，并作好加药标记，观察心搏变化。待曲线出现明显变化时，立即吸取套管中的灌流液，同时作好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗2~3次，待心搏恢复正常。注意：换液时切勿碰套管，以免影响描记曲线的基线，同时保持灌流液面一致。（以下同）1.2.4.3记录改用2%CaCl2溶液的心搏曲线同法向套管中加1~3滴2%CaCl2溶液，观察并记录心搏曲线的变化。当出现明显变化时，立即吸取套管中的灌流液，同时作好冲洗标记，并用新鲜任氏液清洗2~3次，待心搏恢复正常（如果恢复迟缓，可多次冲洗）。1.2.4.4记录改用1%KCl溶液的心搏曲线向套管中加1~2滴1%KCl溶液，记录心搏曲线的变化。当心搏曲线变化时，同法更换灌流液，待心搏恢复正常。1.2.4.5记录改用1：5000肾上腺素溶液的心搏曲线同法记录套管中加入1~2滴肾上腺素溶液（1：5000）后心搏曲线的变化。1.2.4.6记录改用1：10000乙酰胆碱溶液的心搏曲线同法记录套管中加入1~2滴乙酰胆碱溶液（1：10000）后心搏曲线的变化。2实验结果与分析2.1Na+对蛙类离体心脏活动的影响如下图所示，曲线的疏密：反映心跳的频率（心率cadiacrhythmicity,CR）；曲线的规律性：反映心跳的节律；曲线的幅度：反映心肌收缩的强弱（心肌收缩能力cardiaccontractility,CT）。由上图可以看出，当任氏液中加入Na+后，蛙的心搏曲线的基线明显下降，说明Na+对蛙类心脏的收缩性起抑制作用，使心脏的收缩力降低。同时心搏曲线由密变疏，说明心率减慢。心肌细胞的兴奋-收缩偶联在很大程度上依赖于胞外内流的Ca2+，而当Na+浓度升高时，由于Na+与Ca2+竞争性地与肌钙蛋白结合，使得Ca2+与肌钙蛋白的结合能力降低，从而使得钙内流减少，因此心肌收缩力减弱，同时也使心率变慢。2.2Ca2+对蛙类离体心脏活动的影响如下图所示，当任氏液中加入Ca2+后，蛙的心搏曲线的基线明显上升，说明Ca2+对蛙类心脏的收缩性起促进作用，使心脏的收缩力增强。而心搏曲线疏密程度变化不大，说明对心率的影响不大。心肌兴奋-收缩偶联的媒介与骨骼肌一样也是Ca2+，但是钙的来源不同，由于心肌细胞的终末池很不发达，所贮存的Ca2+极少，因而胞内的Ca2+主要来源于细胞外液，即心肌细胞的兴奋-收缩偶联在很大程度上依赖于胞外内流的Ca2+，故细胞外液中的Ca2+浓度对心肌收缩力的影响较大。在一定范围内，细胞外液中的Ca2+浓度升高时，兴奋过程中Ca2+内流量增多，心肌收缩力就强；反之，心肌收缩力就弱。2.3K+对蛙类离体心脏活动的影响如下图所示，当任氏液中加入K+后，蛙的心搏曲线呈下降趋势，说明K+对蛙类心脏的收缩性起抑制作用，使心脏的收缩力降低。同时心搏曲线由密变疏，说明心率减慢。当K+浓度升高时，由于K+与Ca2+竞争性地与肌钙蛋白结合，使得Ca2+与肌钙蛋白的结合能力降低，从而使得钙内流减少，因此心肌收缩力减弱，同时心率也略减慢。2.4肾上腺素（Adr）对蛙类离体心脏活动的影响如下图所示，当任氏液中加入肾上腺素（Adr）后，蛙的心搏曲线呈上升趋势，说明肾上腺素（Adr）对蛙类心脏的收缩性起促进作用，使心脏的收缩力增强。而心搏曲线由疏变密，说明心率变快。肾上腺素是一种儿茶酚胺，能激活心肌蛋白细胞膜上的β受体，cAMP生成增加，从而增加心肌细胞膜对Na+和Ca2+的通透性，降低膜对K+的通透性，从而促进钙通道开放，加速钙内流；并促进肌浆网钙池释放储存的Ca2+；还能促进ATP放能，增加心肌的收缩能力。2.5乙酰胆碱（ACh）对蛙类离体心脏活动的影响如下图所示，当任氏液中加入乙酰胆碱（ACh）后，蛙的心搏曲线的基线呈非常明显的下降趋势，说明乙酰胆碱（ACh）对蛙类心脏的收缩性起抑制作用，而且抑制作用较强，使心脏的收缩力明显降低。同时心搏曲线很明显由密变疏，说明心率减慢程度较大。乙酰胆碱（ACh）可与心肌细胞膜上的M2胆碱能受体结合，增加了心肌细胞膜对K+通透性，降低了膜对Ca2+的通透性，从而直接或间接抑制Ca2+通道，减少了Ca2+的内流，降低了心肌尤其是心房肌的收缩力，同时，也使心率明显减弱。3结论与讨论实验结果表明：Ca2+、肾上腺素（Adr）对蛙类离体心脏的收缩机能起促进作用，而Na+、K+、乙酰胆碱（ACh）对蛙类离体心脏的收缩机能起抑制作用。通过对蛙类离体心脏进行人工灌流的实验，使学生掌握了蛙类心脏暴露及离体的方法，并学会了斯氏蛙心插管法及计算机采集系统、张力传感器的使用方法。通过对改变灌流液成分对蛙类离体心脏心搏曲线变化的观察，使学生更加深刻地理解并掌握了Na+、Ca2+、K+、肾上腺素（Adr）、乙酰胆碱（ACh）对心脏收缩机能的影响。在实验中更改灌流液成分时，使对心脏收缩性起促进作用的药剂与对其收缩性起抑制作用的药剂间隔使用的目的是：避免在连续使用对心脏收缩机能起抑制作用的药剂下，导致心脏收缩力严重减弱难以恢复正常或心跳停止。