蛹虫草菌丝体中虫草素的提取及研究进展

生命科学学院2006级生物技术2班谭艳妮261303202蛹虫草菌丝体中虫草素的提取及研究进展【摘要】：概述蛹虫草的生物学特性，综述其在人工栽培技术、液体深层发酵、化学成分和药用价值等方面所取得的研究进展及开发现状，为蛹虫草进一步的研究与开发提供参考。。本文以蛹虫草菌为实验材料，系统而深入地研究了蛹虫草液体发酵的培养基及培养条件的优化，并在所得的优化培养基及培养条件下进行扩大培养。然后对菌丝体和发酵液中的多糖，菌丝体中的虫草素分别进行了含量测定，通过正交实验优化蛹虫草培养成分，提高虫草菌素含量,获得提取的最佳工艺条件。【关键词】：生物学特性、液体发酵、培养工艺、虫草多糖、虫草素、提取分离CordycepsmyceliaofCordycepsandresearchprogressoftheextractionAbstract:AnoverviewofthebiologicalcharacteristicsofCordycepsmilitarissummarizingitsartificialcultivationtechniques,liquidsubmergedfermentation,chemicalcompositionandmedicinalvalueoftheprogressachievedintheareaofresearchanddevelopmentofthestatusquo,inordertoprovideareferenceC.militarisforfurtherresearchanddevelopment..Inthispaper,Cordycepsfungiasexperimentalmaterials,systemsandin-depthstudyoftheCordycepsfermentationliquidmediumandoptimizationofcultureconditionsandoptimizationoftheproceedsunderconditionsofmediumandculturedtoexpandcultivation.Andthenmyceliumandthefermentationbrothofpolysaccharides,Cordycepsmyceliaintheassaywereconductedrespectively,throughtheoptimizationofCordycepscultivationorthogonalcomponents,improvethecordycepincontent,accesstotheoptimumconditionsforextraction.Keywords:biologicalcharacteristics,liquidfermentation,cultivationtechniques,Chinesecaterpillarfunguspolysaccharide,Cordyceps,extractionandisolation生命科学学院2006级生物技术2班谭艳妮2613032021前言蛹虫草(Cmilitaris)最早源于中国，俗称北虫草，由于其药用价值与冬虫夏草(csinensis)相似，故药典中义记载为“北冬虫夏草”（5）国外最早的报道是1723年Vaillant在他所著《BotanieonParisiense》一书中，提到了蛹草和大团囊虫草（6），通过基源鉴定认为它与冬虫夏草是同一个属。自1727年在巴黎科学院院士会上，作为虫草属的模式种具属种“Cordycepsmilitaris”发表以来，迄今已有282年历史了，此后，我国陆续有标本输往欧洲及亚洲的日本，引起了各国学者的极大兴趣，并针对各自本国的虫草资源，进行了一定的驯化和生态研究（7）。蛹虫草与冬虫夏草同属异种，是国内外公认的食药用真菌，民间用于肺炎、肾虚、腰痛等疾病的治疗。蛹虫草对于生长环境的要求较低．液体发酵可形成菌丝体．人工大规模同体培养可获得子座，也可通过活体培养进行规模化蛹虫草生产。现有的多数文献认为人工培养的蛹虫革其有效成分和含量与冬虫夏草相仿．有的甚至更高。所以，近年来蛹虫草的研究取得了迅速的发展。生物学特性蛹虫草是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目、鞘翅目和双翅目昆虫蛹体上形成的子座(子实体)与蛹体的结合体。子座单生或数个一起从寄主蛹虫的头部或节部长出，颜色为橘黄或橘红色，全长2-8cm，头部椭圆形，长1-2cm，粗2—9mm；柄长1．5-3．5cm，粗1—3mm，颜色为浅黄色。生命科学学院2006级生物技术2班谭艳妮261303202寄主蛹体为椭圆形，有环纹9个，蛹体颜色为绛紫色，长1．5-2cm，粗5—9mm(95).蛹虫草在PDA培养基上形成的菌落呈圆形或椭圆形，表面蓬松，凸起呈棉絮状的半球形，菌丝为白色，气生菌丝发达，边缘整齐，较易挑取。分生孢子为圆形或圆柱形，其大小为2．5～3．2μm×6．8μm；分生孢子着生在孢子梗的项端，或成单，或成对，或成簇排列；分生孢子梗单生或有分枝。菌丝有隔膜，粗细均匀，但老龄菌丝内会形成空泡(23)。虫草素的研究概况1951年，Cuningham等观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，随后从中分离到一种腺苷类活性物质，命名为虫草菌素(Cordycepin)，确定其结构式为：在此之后Kaeaka等(67)从无冠构巢曲霉亦分离出这种物质，这是迄今在虫草属真菌以外惟一报道分离出虫草菌素的菌种。此后在虫草属其它一些种中也检测到虫草菌素的存在。虫草菌素又称虫草素、蛹虫草菌素，3’-脱氧腺苷，它是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素，其分子量为251．24，熔点230—23l℃，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波长为259nm(68-69)。Kredich等(1961)首先对虫草素的生物合成机理作了研究，表明虫草素的合成是以腺苷为直接前体。1960年，Todd和Ulbricht首先完成了3’-脱氧腺苷的全化学合成；1964年我国南京药学院也人工合成了虫草素(70)。生命科学学院2006级生物技术2班谭艳妮261303202人工栽培现状子实体培养DeBary在19世纪60年代首次进行了蛹虫草的人工培养研究，随后人们又进行了大量的培养研究，并最终成功获得了蛹虫草的子实体（24）。日本的小林和久山1932年两次在100℃蒸汽灭菌的米饭上培养出蛹虫草子实体。英国的ShanorT．Petchl等研究认为蛹虫草菌在麦芽琼脂上容易生长，但把分生孢子接种到经过高压灭菌后的同种昆虫蛹上没有得到子囊壳（25）。目前，世界上人工培养虫草子实体种类最多的是日本研究者失秋信夫，他在日本的特许公报上发表的专利文献中报道了成功实现人工培养的包括蛹虫草在内的虫草种类达74种之多（26）。20世纪70年代国外又开展了蛹虫草液体深层发酵的研究。除此之外，日本的松本藩(1959)和吉井常人(1979)还提出了从液体培养的蝉花和蛹虫草菌丝体中提取甘露醇和制备气粉剂的方法（25）。此外，韩国的Choi，YJ．等也对人工培养蛹虫草子实体进行了很多的研究（26）。国内在蛹虫草人工栽培方面的研究比国外开展得晚，但近二十年来国内对蛹虫草的人工栽培以及影响子实体形成的培养方法、培养条件以及有效成分、药理作用等方面进行了大量的研究，有了长足的进步。1986年吉林省蚕业研究所以家蚕和柞蚕为寄主培养蛹虫草成功获得了子实体（27）。后来人们先后在柞蚕和桑蚕活蛹、家蚕、蓖麻蚕蛹以及樗蚕蛹等蛹体上种植蛹虫草成功（28）。但这种传统的栽培方式生命科学学院2006级生物技术2班谭艳妮261303202难以实现大规模工业化生产，又由于保健与医药事业对子实体的需求日益加大，人们开始把蛹虫草的人工培养转化到代料栽培的研究上来。陈顺志等（29）瓶栽蛹虫草成功，并提出子座的色泽与光线强弱有关；郑晴霞等（30）首次将蛹虫草菌直接接在培养基上，并长出子座；而且提出可以直接利用液体培养菌丝体。姜明兰等（31）用野生菌进行组织分离，在PDA培养基上分离、纯化出优良的原种，经人工驯化的原种在PDA液体培养基中扩大培养后，接种到大米培养基上，在一定条件下获得先端膨大呈棒状的子实体。张显科等研究认为，高粱米、小米、玉米渣和蚕蛹可以代替大米栽培蛹虫草，后来刘守华实验得出大米加猪血培养基更适宜虫草菌丝的生长，使产量有所提高（32-33）。冉翠香等发现人工蛹虫草培育成功的关键在于诱发子实体原基的形成，认为温差刺激对子实体原基形成的效果较好（34）。液体发酵培养19世纪50年代以后，国外已经尝试通过液体深层培养法获得虫草菌丝体。后来的实验研究证明，这种方式生产的菌丝体的化学组成与从天然采集的虫草的化学组成几乎相同，而且可以从发酵液中得到人们需要的物质，同时大大缩短生产周期。有关液体深层发酵培养条件的报道更多的涉及到了三种虫草，包括蛹虫草(C.militaris)、C.pruinosa和C.iiangsiensis（35-40）。KimH．O．和YunJ．W．(41)通过摇瓶实验比较了蛹虫草和冬虫夏草的最佳液体发酵条件，认为蛹虫草在40gm蔗糖、5gm玉米浸出粉、起始pH8．0，30℃时培养能够得到最大产量。KimS．W．(42)针对蛹虫草液体发酵从发酵流体学方生命科学学院2006级生物技术2班谭艳妮261303202向进行了探讨，并将优化的条件应用到了发酵罐。国内在20世纪80年代开始将液体培养(发酵)技术应用于冬虫夏草，蛹虫液体发酵的报道始于20世纪90年代初期，当时郑晴霞(43)采用液体发酵方法培养菌丝体获得成功，随着蛹虫草市场需求量的不断增加，为开发利用蛹虫草及其制品，近年来对蛹虫草液体发酵培养的研究逐步增多。研究结果表明不同的蛹虫草菌种菌丝培养要求的最佳碳源和氮源不同，对培养基、温度、pH值以及无机元素的要求也有差异。近来，也有利用液体深层发酵培养来提高虫草多糖和虫草素等代谢产物产量的报道(44-45)。2材料与方法试剂蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、白糖、可溶性淀粉；蛋白胨、酵母膏、硝酸钠、氯化铵、牛肉膏；MgS0₄、K₂HP0₄、FeS0₄、KH₂P0₄、CuS0₄、Vв₁；乙醇、丙酮、乙醚等所有试剂均为国产分析纯。实验仪器SRSL280手提式电煤两用灭菌器SW-CJ-1F洁净工作台LRH-250-G光照培养箱CHA-S恒温振荡器LD5-10型低速离心机生命科学学院2006级生物技术2班谭艳妮261303202雷磁PHS-3B精密pH计SHB-95型全塑不锈钢循环水多用真空泵上平FAl004电子天平101A-2型干燥箱培养基1斜面培养基：PDA培养基土豆0.2%葡萄糖2.0%蛋白胨0.5%K₂HP0₄0.1%MgS0₄₂•7H₂00.01%琼脂2.0%Vв₁1mg/l2种子培养基：蔗糖5.0%，酵母浸出粉1.0%，蛋白胨1.0%3发酵培养基(合成)：砂糖/蔗糖3.0%蛋白胨3.0%酵母浸出粉3.0%K₂HP0₄0.1%MgS04₂•7H₂00.05%CaCl₂0.01%菌种蛹虫草菌试验方法2.2.1培养基的配制选用上述配方，按所需量称好各种原料放入三角瓶中。2．2．2培养基灭菌在高压湿热灭菌锅内灭菌，灭菌后将其取出分装入三角瓶内，每个三角瓶的装样量为：种子培养基130mL/50ml；发酵培养基100ml／500ml。2．23接种。在超净台中，先将制备好的斜面培养基上的母种(25C⁰生命科学学院2006级生物技术2班谭艳妮261303202培养5．6d)取1块6-10mm大小的菌苔接入种子培养基(装样量为130ml/50ml三角瓶)中，在27℃恒温振荡器上发酵72h，形成微小的菌球。2．2．4转接72h后，再将小菌球以10％装样量转接至发酵培养基(装样量为100ml/500ml三角瓶)中，相同条件下培养。2．2．5菌丝体干重测定方法将发酵液在4000r／min离心20min，弃去上清夜，将湿菌体用蒸馏水洗净后置烘箱中60⁰C烘至恒重。2．2．6菌丝体多糖的提取方法将得