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蛋白质的测定方法-凯氏微量法有手工滴定定氮和自动定氮仪定氮,实验者可根据经济条件设备而定。1.原理蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+2H2O+Na2SO42.方法本法参照GB5009.5-85,适用于各类食品及饲料中蛋白质的测定。3.试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。1)硫酸铜2)硫酸钾3)浓硫酸4)2%硼酸溶液(或1%的硼酸)5)混合指示剂:1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1%甲基红乙醇溶与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。6)饱和氢氧化钠:500g氢氧化钠加入500mL水中,搅拌溶解,冷却后放置数日,澄清后使用。7)0.01mol/L或0.05mol/L盐酸标准溶液:需标定后使用(配制及标定方法见附录)4.仪器1)消化炉;2)凯氏定氮蒸馏装置;3)万分之一电子天平4)凯氏定氮蒸馏装置:如图所示1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5.玻璃杯6.棒状玻塞7.反应室8.反应室外壳9.夹子10.反应室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网图3.4微量凯氏蒸馏装置示意图5.操作步骤1样品处理:精密称取0.1~2.0g固体样品或2~5g半固体样品或吸取液体样品5~20mL,放入100mL或500mL凯氏烧瓶中,加入0.2g硫酸铜,0.3g硫酸钾及3~20mL浓硫酸,放置过夜后小心加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,取下放冷后用约2~10mL蒸馏水冲洗瓶壁,混匀后继续加热至液体呈蓝绿透明,取下放冷,小心加10~20mL水混匀,放冷后,移入100mL容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白实验。2按图装好定氮装置,于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处,加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠以防暴沸,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。3向接收瓶内加入10mL,1~2%硼酸溶液及混合指示液1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10mL样品消化稀释液由小玻璃杯流入反应室,并以10mL水洗涤小烧杯使之流入反应室内,塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将3~10mL饱和氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯中,提起玻璃塞使其缓缓流入反应室,立即将玻璃塞盖紧,并加水于小玻璃杯中以防漏气。加紧螺旋夹,开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内,蒸馏2min,移动接收瓶,使冷凝管下端离开液面,然后用少量中性水冲洗冷凝管下端外部,再蒸馏1min取下接收瓶,以0.01或0.05mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10mL试剂空白消化液按5.3操作。6.计算X=(V-V0)×C×0.014×B/m×100×F式中:X—样品中蛋白质含量,g/100g;V—样品消耗盐酸标准液的体积,mL;V0—空白消化液消耗盐酸标准液体积,mL;C—盐酸标准液摩尔浓度,mol/L;0.014—1mol/L盐酸标准液1mL相当氮克数;B—定容体积/取液量;m—样品的质量,g;F—氮换算为蛋白质计算因子。蛋白质的氮素含量不同,故换算因子不同。详见下表。蛋白质计算因子食物计算因子:蛋,鱼,肉及制品,禽类,玉米,高粱,豆类,水果和蔬菜类6.25;乳及乳制品6.38;大米5.95;小麦面普通粉5.70;全麦,大麦,燕麦,裸麦,小米,小麦面全麦5.83;小麦5.80;黄豆5.71;花生5.46;芝麻、向日葵、核桃和榛子5.30;麸皮6.317.举例设取样品0.1000g,消化后稀释至100mL。取10mL样品稀释液,标准盐酸为0.01mol/L,空白滴定为0.12mL,样品滴定用去的标准盐酸为3.21mL,测得样品中蛋白质百分率为:(3.21-0.12)×0.01×0.014×10/0.01×100×6.25=(3.21-0.12)×8.75=27.0%8.附录:(1)标准HCl溶液(0.1mol/LHCl)配制及标定:配制:量取9毫升HCl,加适量水稀释至1000毫升。标定:精确称取约0.15克左右在270~300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠,加50毫升水使之溶解,加10滴溴甲酚绿-甲基红混合指示液,(量取30mL0.2%溴甲酚绿乙醇溶液,加入20mL0.1%甲基红乙醇溶液,混匀)用配制的盐酸滴定至溶液由绿色变紫红色,煮沸2min,冷却至室温,继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。同时做试剂空白实验。(2)计算:C=m(V-V0)×0.0530C—HCl标准滴定溶液的实际浓度,mol/L;m—基准无水碳酸钠的质量,g;V—HCl标准滴定溶液用量,mL;V0—试剂空白HCl标准滴定溶液用量,mL;0.0530—1.00mLHCl标准滴定溶液〔C(HCl)=1mol/L〕相当基准无水碳酸钠g。0.01mol/LHCl:精确吸取标定过的0.1mol/LHCl10mL,准确稀释至100毫升。必要时重新标定浓度。9.注意事项:1)干样用称量纸称重连纸一同消化,空白管同样放称量纸消化。2)含糖量高和油脂高的样品消化时容易溢出,加热要缓慢。3)稀释样品时消化液过热,加水反应猛烈使样品损失;消化液过冷,加水后盐析不溶解。食品中脂肪的测定方法GB5009.6-85酸水解法1原理:样品经酸水解后用乙醚提取,除去溶剂即得游离及结合脂肪总量。2试剂:1.盐酸2.95%乙醇。3.乙醚。4.石油醚。3仪器100mL具塞刻度量筒。4操作方法1.样品处理1)固体样品:精密称取约2g,置于50mL大试管内,加8mL水,混匀后再加10mL盐酸。2)液体样品:称取10.0g,置于50mL大试管内,加10mL盐酸。2.将试管放入70~80℃水浴中,每隔5~10min以玻璃棒搅拌一次,至样品消化完全为止,约40~50min。3.取出试管,加入10mL乙醇,混合。冷却后将混合物移于100mL具塞量筒中,以25mL乙醚分次洗试管,一并倒入量筒中。待乙醚全部倒入量筒后,加塞振摇1min,小心开塞,放出气体,再塞好,静置12min,小心开塞,并用石油醚-乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪。静置10~20min,待上部液体清晰,吸出上清液于已恒量的锥形瓶内,再加5mL乙醚于具塞量筒内,振摇,静置后,仍将上层乙醚吸出,放入原锥形瓶内。将锥形瓶置水浴上蒸干,置95~l05℃烘箱中干燥2h,取出放干燥器内冷却0.5h后称量。
本文标题:蛋白质含量的测定方法
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