血小板源性生长因子BB表达对促进大鼠肌腱愈合和防止肌腱粘连的作用

血小板源性生长因子BB表达对促进大鼠肌腱愈合和防止肌腱粘连的作用南京大学医学院附属鼓楼医院林樾梁红伟李云剑燕辛谭谦【摘要】目的研究血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）基因转染大鼠肌腱细胞后促进肌腱愈合及防止肌腱粘连的作用。方法90只大鼠随机分为A、B、C三组，建立跟腱损伤模型。A组：实验组，肌腱断端注射PDGF-BB基因转染的肌腱细胞；B组：对照组，肌腱断端注射肌腱细胞；C组：空白对照组。6-0丝线行改良Kessler法缝合跟腱，管型石膏固定一周。术后第3d、1w、2w、4w、8w取样，分别行大体、组织学观察、力学以及免疫学检测，对比肌腱粘连度、组织中成纤维细胞数量、胶原纤维含量、肌腱最大抗拉力及最大滑动距离、组织中PDGF-BB的浓度。结果PDGF-BB基因转染肌腱细胞经过RT-PCR以及测序证实在体外稳定表达。实验组在肌腱粘连度、胶原纤维数量、成纤维细胞数量、肌腱最大滑动距离以及组织中PDGF-BB含量等方面均优于对照组（P0.05或P0.01）,但在肌腱最大抗拉力方面与对照组无统计学差异(P0.05)。结论运用PDGF-BB基因转染肌腱细胞注射有促进肌腱内源性愈合、减轻肌腱粘连的作用。【关键词】PDGF-BB基因；肌腱愈合；肌腱粘连；基因转染【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofplatelet-derivedgrowthfactor-BB（PDGF-BB）geneexpressionintheprocessofpromotingrattendonhealingandpreventingadhesionofrattendon.Methods90ratswererandomlydividedintothreegroups(gorupA、BandC),establishedtendoninjurymodels.GroupA:injectedPDGF-BBgenetransfectedrattendoncellsintheendofinjurytendon;GroupB:injectedtendoncells;GroupC:control.Thensamplesweretakenfromratstendonsindifferenttimesincluding3days,1week,2weeks,4weeksand8weeksafteroperation.Morphologyandhistologyobservation、mechanicaltestingandimmunoassayweregiven.TheeffectofPDGF-BBgenetransfectedrattendoncellsintheprocessofpromotingtendonhealingandpreventingadhesionoftendonswereprovedbycomparingofthedegreeoftendonadhesion;Thenumberoftissuefibroblastsandcollagenfibercontent;tendonmaximumtensilestrengthandthemaximumslidingdistanceafterthetendonhealing;levelsofPDGF-BBintendontissueaswell.ResultsThetransfectionofPDGF-BBgeneintotendoncellsweretestifiedbyRT-PCRandsequencing,andPDGF-BBcouldstablyexpressedinvitro.Comparedwithcontrol,thePDGF-BBgenetransfectedrattendoncellshadmoreadvantagesinthedegreeoftendonadhesion;Thenumberoftissuefibroblastsandcollagenfibers;themaximumslidingdistanceandthecontentofPDGF-BBintendontissue（P0.05orP0.01）,whiletherewasnoobviousstatisticalsignificanceinthelargesttendontensilestrengthandsoonwiththecontrolgroup.ConclusionTheinjectionofthePDGF-BBgenetransfectedrattendoncellshadtheeffectofpromotingtendon’sendogenoushealingandpreventingadhesionoftendons.【Keywords】:PDGF-BBgene;Tendonhealing;Tendonadhesion;Genetransfection肌腱损伤是外伤后较为常见的一种疾病，由于肌腱组织的特殊性，其修复后往往因为严重的粘连而引起功能障碍。目前对肌腱的研究已证明，在肌腱的修复过程中存在外源性修复和内源性修复两种机制。所谓内源性修复是指通过组织液营养下肌腱细胞自身修复损伤所达到的愈合，这种愈合可以避免肌腱粘连的形成。而外源性愈合是指通过肌腱外周组织的滑膜及结缔组织在肌腱断端产生肉芽组织，同时肌腱外膜中的成纤维细胞增殖并随毛细血管长入肌腱断面，最终通过肉芽组织修复损伤，这种愈合速度较快，但粘连较重。在肌腱修复的过程中，两种机制同时作用，通常情况下外源性愈合占主导地位，因此肌腱的愈合过程不可避免产生粘连，影响正常功能。由此可见，在肌腱损伤的修复中，如何促进内源性愈合，延缓外源性愈合是预防肌腱粘连的另一条途径。本文通过将血小板源性生长因BB（PDGF-BB）基因转染大鼠肌腱细胞，并获得稳定表达的肌腱细胞，将其注入大鼠肌腱断端，研究其在促进肌腱愈合、防止肌腱粘连方面的作用和机制。材料和方法1.动物来源及主要试剂：SD清洁级大鼠90只，重量（124±15）g，由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供。胎牛血清（杭州四季青）；F12培养基（美国Gibco公司）；Lipofectamine™2000（美国invitrogen公司）；PDGF-BBElisa试剂盒（武汉中美公司）；PDGF-BB（美国R&D公司）；I型胶原酶(美国Amersco公司)；0.25%胰蛋白酶(美国Invitrogen公司)；抗大鼠I、III型胶原抗体（美国Bioworld公司）；SABC免疫组化检测试剂盒（武汉博士德公司）。2.动物模型：术前氯胺酮(30mg/kg)肌肉注射麻醉,无菌条件下,于大鼠右后肢行足跟纵切口,打开跟腱鞘管,挑出跟腱,横行切断,肌腱断端用不同方法处理后，6-0丝线行改良Kessler法缝合跟腱，术后管型石膏固定大鼠患肢一周。3.实验分组：实验动物随机分为A、B、C三组，A组,实验组，PDGF-BB基因转染的肌腱细胞（密度108个/ml），20μl，断端注射；B组,对照组，未转染肌腱细胞（密度108个/ml），20μl，断端注射；C组，空白对照组，不行任何处理直接缝合。4.检测指标：术后3d、1w、2w、4w及8w五个时间点,分别每组随机处死6只大鼠，行跟腱大体、组织学及免疫学检测；术后4w和8w分别每组再取4只大鼠跟腱行生物力学测定。4.1大体观察观察肌腱的愈合及粘连情况。分别于术后第4周和第8周取标本观察,各组肌腱粘连程度按汤锦波等在肌腱粘连分级标准进行分级【1】。4.2组织学观测取断端两侧1.5mm范围内的肌腱组织，常规石蜡包埋，行肌腱纵切面切片，①HE染色：测定缝合处附近1mm范围内肌腱内成纤维细胞数目；②Masson染色:测定术后第4、8周断端附近1mm范围内肌腱内胶原纤维面积占测量窗面积的百分比。以上每个标本均利用计算机在高倍视野(×400)下5个窗口测量取平均值，测量窗面积13000μm2。4.3生物力学测定将大鼠处死后，右后肢膝关节离断，去除足部除跟腱外其他软组织，通过夹具将大鼠足部固定于力学测定仪的下端夹具，将跟腱的近端固定于仪器的上端夹具。用20g钢针外固定捆扎大鼠足趾作为预负荷。将力学测定仪调零。肌腱滑动距离：设定拉伸速度为1cm/min、最大拉力为50N后开始测试，测定达到最大拉力时肌腱的滑动距离。肌腱最大抗拉力：测定肌腱被拉断时所需的拉力。以上测定结果均由计算机直接生成。4.4免疫学检测：分别于术后第3天、第1、2、4和8周五个时间点采集大鼠跟腱吻合口两侧1.5mm范围内的腱鞘和肌腱组织100mg，提取总蛋白，采用Elisa方法，通过绘制标准曲线，定量检测大鼠跟腱中PDGF-BB的含量。5．统计学方法所有数据均应用SPSS13.0统计学软件处理。结果以均值±标准差表示（χ±ｓ），组间以t检验进行处理，P＜0.05为差异有显著意义。结果1．转染PDGF-BB基因的大鼠肌腱细胞鉴定构建的pcDNA3.1/Myc-HisB–PDGF-BB质粒经测序证实。转染大鼠肌腱细胞后由该组大鼠肌腱细胞RNA成功扩增出目的基因片段(573bp),而对照组RNA没有扩增出目的基因片段(图1)。证明转染pcDNA3.1/Myc-HisB–PDGF-BB的肌腱细胞有PDGF-BBmRNA的正确表达。2．大体观察：术后3天，各组切口均未愈合，肌腱周围伴有较明显肿胀，术后1-2周，各组切口基本愈合，肌腱及腱周组织水肿逐渐减少，并逐渐出现与周围组织粘连；术后4周，各组肌腱粘连明显，滑动性差，腱断端被较牢固的纤维组织连接，其中C组肌腱粘连最严重。术后8周，各组肌腱粘连较4周均减轻，各组肌腱粘连程度分级差异均无统计学意义(P0.05)(表1)。图1RT-PCR检测PDGF-BBmRNA的表达：1.marker2.转染组RT-PCR3.转染组β-actinRT-PCR4.未转染组RT-PCR5.未转染组β-actinRT-PCR表1术后8周各组肌腱粘连程度分级(n=10)组别肌腱粘连分级Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级Ⅳ级Ⅴ级A组01231B组11233C组012253.组织学观察：术后3天各组肌腱断端均可见充血水肿及炎细胞浸润；术后1周，充血、水肿较术后3天有所减少，同时胶原纤维增生，炎性细胞向胶原纤维浸润，并见吞噬细胞活跃；腱周组织可见毛细血管增生、成纤维细胞增殖活跃，其中以C组最明显；A组细胞数量相对较少（P0.05），而B、C组近断端的腱实质内可见较多成纤维细胞增殖，断端有新生胶原形成，并出现较多的新生毛细血管。术后2-4周，各组肌腱的炎性反应逐渐消退，成纤维细胞增殖活跃并向肌腱断端迁移，可见排列紊乱的胶原成分和毛细血管增生。术后8周,各组成纤维细胞数较前明显减少，组间数量趋于一致。肌腱断端胶原纤维的排列方向趋于一致，与肌腱纵轴平行，肌腱与周围组织的粘连较前减轻。愈合过程中B、C组各部位的成纤维细胞及胶原纤维含量均较A组多（P0.05），肌腱粘连也较重(图2、3，表2，3)。图2各组肌腱HE染色粘连度观察×100：A组PDGF-BB转染组，B组未转染细胞组，C组对照组图3各组肌腱Masson染色胶原纤维含量观察×100：A组PDGF-BB转染组，B组未转染细胞组，C组对照组表2各组各时间点成纤维细胞计数（个）（χ±ｓ）术后3天术后1周术后2周术后4周术后8周A组153.2±18.4a145.0±19.6ab130.2±20.0ab117.9±16.5ab98.5±13.8abB组170.4±25.7165.3±24.1b160.1±15.2b163.7±20.5b149.2±16.0bC组192.1±23.2a187.2±19.3a180.5±24.1a163.1±23.9a158.0±19.3a注：表中数据为单位面积内成纤维细胞计数，A组为实验组，与对照组相比aP0.01,与肌腱细胞组对比bP0.05表3各组各时间点胶原纤维含量（%）（χ±ｓ）术后4周术后8周A组43.46±5.69