第十九章高校液相色谱HPLC

第十九章高效液相色谱分析法一、高效液相色谱法概述二、高效液相色仪三、色谱峰展宽因素及分离条件选择四、高效液相色谱固定相和流动相highperformanceliquidchromatograph一、液相色谱仪器highperformanceliquidchromatograph概述高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography；HPLC）是在60年代末，以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，发展而成的分离分析方法。它与经典液相色谱法的主要区别是：流动相改为高压输送、采用高效固定相、具有在线检测器、仪器化。二、高效液相色谱法的特点featureofHPLC特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高效液相色谱法与经典液相色谱法对比经典LCHPLC固定相,一般规格特殊规格固定相粒度（μm）75-5003-20固定相粒度分布（RSD）20％-30％＜5％柱长（cm）10-1007.5-30柱内径（cm）2-50.2-0.5柱入口压强（MPa）0.001-0.12-40柱效（每米理论塔板数）10-100104-105样品用量（g）1-1010-7-10-2分析所需时问（h）1-200.05-0.5装置非仪器化仪器化二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象差别大，HPLC应用广泛GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%续前2．流动相差别，HPLC的选择性高GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）HPLC的缺点仪器昂贵缺乏通用性高灵敏检测器分析周期长日常运行成本高流动相污染环境空气危害操作人员健康一、高效液相色谱法的主要类型液液色谱法液固色谱法吸附色谱法分配色谱法空间排阻色谱法离子交换法亲合色谱法化学键合相色谱法胶束色谱法按固定相的聚集状态分类按分离机制分类第二节高效液相色谱仪1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置一、液相色谱仪器highperformanceliquidchromatograph液相色谱仪（2）液相色谱仪（3）液相色谱仪（4）流程及主要部件processandmainassemblyofHPLC1.流程一、高压输液泵(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性恒压泵恒流泵1、柱塞往复泵输液泵的要求：无脉冲、流量恒定、流量可以自由调节、耐高压、碉腐蚀、适于进行梯度洗脱梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。二、进样系统完整的分离和进样系统包括进样器、色谱柱、柱的进出口接头及至检测器的导管。1、进样器六通进样阀1.进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(4)高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。二、色谱柱2、色谱柱分析型：内径2~4.6mm，柱长10~25cm制备型：内径20~40mm，柱长10~30cm3、色谱柱柱效的评价“色谱条件与系统适用性试验”给出分析状态下色谱柱最小理论塔板数、分离度和拖尾因子。三、检测系统一)检测器的要求：灵敏度高;噪声低;线性范围宽;重复性好;适用化合物的种类广。三、检测系统可变波长型检测器光电二极管阵列检测器三、检测系统二)、紫外检测器UVD优点：灵敏度高，噪音低，不破坏样品可用于制备，对温度及流动相流速波动不敏感，可用于梯度洗脱。缺点：只能检测有紫外吸收的样品；流动相选择有一定限制，检测波长必须大于流动相的截止波长。二)紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；工作原理为Lamber-Beer定律线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。可变波长紫外光测定器示意图2.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。光电二极管阵列检测器三)荧光检测器（fluorescencedetector）高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；四).示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；五)其他检测器1.安培检测器2蒸发光散射检测器一)高效液相色谱法的速率理论（填充柱）：uCuBAHGC/（毛细管柱）或uCuBH/dpA2dpAgmDDB22gRDBtB，MTDTDgg或llgsmCCCCCCllDdfC2TDL1.一)高效液相色谱法的速率理论HPLC是将LC与GC基本原理和实验方法相结合而产生。两者主要差别是流动相性质不同VanDeemter方程式：GCH=A+B/u+Cu毛细管开口柱H=B/u+CuHPLCH=A+Cu（流动相是液体，粘度比气体大的多，柱温为室温，而且流速至少是最佳流速的3-5倍，综上原因可忽略纵向扩散项）图示back影响HPLC色谱峰宽的因素涡流扩散项AA=2λdp降低固定相直径dp(3-5μm)降低λ。采用球形、窄粒度分布（RSD5%）固定相及匀浆装柱。影响HPLC色谱峰宽的因素纵向扩散项纵向扩散系数:因流动相黏度大,组分的纵向扩散系数很小,纵向扩散项可以忽略.uCAHHPLC：mDB2TDm相忽略大低，流动相柱温BT影响HPLC色谱峰宽的因素传质阻抗系数CGCC=CsHPLCC=Cm+Csm+Cs化学键合相，固定液为键合在载体表面的官能团的单分子层HPLCC=Cm+CsmVandeemter方程在HPLC中的表现形式：HPLCH=A+Cmu+Csmu续前3）传质阻抗项及其影响）（忽略固定相传质阻抗smmssmmCCCCCC忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静uCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，，但易产生气泡mmDTCDTHPLC分离条件的选择采用小粒度、窄分布的球形固定相，首选化学键合相，用匀浆法装柱。采用低粘度流动相，低流量（1ml/min）。柱温以25℃为宜。太低，则使流动相的粘度增加。用水溶液为流动相的色谱法（如IEC）可按需升温。分离条件的选择1．22114kknRuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n''''12121212RRRRVVttkkKK温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性0'ttVVKVCVCWWkRmsmmssms小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k第四节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择固定相的条件：1）颗粒细且均匀2）机械强度高且耐高压3）传质快4）化学稳定性好且不与流动相发生化学反应。一化学健合相色谱法的固定相用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体表面上，所形成的填料称为化学健合相(chemicallybondedphase)，简称键合相。键合相的优点：使用过程官能团不流失；化学性能稳定，在pH2~8的溶液中不变质；热稳定性好，一般在70℃以下稳定；载样量大，比硅胶约高一个数量级；适于作梯度洗脱。化学健合相色谱分离机制一般的化学键合相具有分配作用及一定的吸附作用，吸附作用的大小，视键合覆盖率而定。用化学反应方法将载体表面上残存的硅醇基除去，称为封尾、封顶或遮盖(endcapping)，所形成键合相称为封尾键合相。这种键合相没有吸附作用。1、非极性键合相这类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基与苯基(可诱导极化)等。十八烷基(octadecylsilyl，ODS或C18)犍合相是最常用的非极性键合相。将十八烷基氯硅烷试剂与硅胶表面的硅醇基，经多步反应生成ODS键合相。键合反应简化如下：3718237182)()(HCRSiOSiHCRSiClOHSiHCl3.弱极性键合相一般为醚基或二羟基键合相应用较少载体性质；多数产品采用全多孔YWG、YQG或堆积硅球作为ODS键合相的载体。载体的比表面决定键合基团的总量，总量大，k大，保留时间长。涡流扩散项与柱渗透性，取决于载体的形状，以球形为好。国产品：YWG-C18H37(5、10μm)、YQG-C18H37(堆积硅珠，3~5μm)及YWG-C6H5(5、10μm)等。进口品：NucieosilC18(球形，3或5μm)及Partisil5-ODS(无定形，5μm)等。表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例，称为该固定相的表面覆盖度。覆盖度的大小，决定键合相是分配，还是吸附占主导。Partisil5-ODS的表面覆盖度为98％，即残存2％的硅醇基，分配占主导。PartisH10-ODS的表面覆盖度为50％，既有分配又有吸附作用。封顶键合相只有分配作用，如国内产品YWG-FN是用氟酰胺遮盖了硅胶的一些吸附部位，分离效果良好，但疏水性强，在同样分离条件下，柱压高于普通键合相柱。二、化学键合相色谱法的流动相1．对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度k=1~10k=2~5最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）注意:使用前过滤、脱气!!!二、化学键合相色谱法的流动相2.流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。3.流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵