第十五章氨基酸多肽蛋白质

第十五章氨基酸多肽与蛋白质蛋白质:天然高分子化合物，是生命的物质基础，生物体内一切组织的基本组成部分，除水外，细胞内80％都是蛋白质。生命活动的基本特征就是蛋白质的不断自我更新。蛋白质是一切活细胞的组织物质，也是酶、抗体和许多激素中的主要物质。所有蛋白质都是由α-氨基酸构成的，因此，α-氨基酸是建筑蛋白质的砖石。要讨论蛋白质的结构和性质，首先要研究α-氨基酸的化学。15.1氨基酸15.1.1分类、结构和命名•组成蛋白质的氨基酸（天然氨基酸）都是α-氨基酸，即在α-碳原子上有一个氨基，可用下式表示：RCNH2HCOOH天然产的各种不同的α-氨基酸只R不同而已。目前在自然界中发现的氨基酸已有200余种，但在生物体内作为合成蛋白质的原料只有二十种（见P285表15-1）。必需氨基酸：人体内不能合成，只能从食物中得到，共有８种：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸。1.分类•按烃基类型分：脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸•按分子中氨基和羧基的数目分：中性氨基酸，酸性氨基酸，碱性氨基酸。a.中性氨基酸：分子中氨基和羧基数目相等的氨基酸，但并不是真正的中性物质b.碱性氨基酸：分子中氨基、胍基、咪唑基等碱性基团数目多于羧基的氨基酸c.酸性氨基酸：分子中羧基的数目多于氨基等碱性基团的氨基酸。2.命名：多按其来源或性质而命名,国际上有通用的符号（见P285表15-1）。3.构型：用D/L体系表示——在费歇尔投影式中氨基位于横键右边的为D型，位于左边的为L型。天然氨基酸（除甘氨酸外）α-碳原子都是手性的，都有旋光性，而且发现主要是L型的。注意：用D，L表示构型时，氨基酸是以距羧基最近的手性碳原子为标准15.1.2物理性质无色晶体，易溶于水难容易非极性溶剂，加热至熔点则分解，与一般的有机物有较大区别。15.1.3化学性质氨基酸分子中的氨基显碱性，而羧基显酸性，因而氨基酸既能与酸反应，也能与碱反应，是一个两性化合物。RCHCOOHNH2RCHCOONH2RCHCOOHNH3OHH1.氨基酸的酸-碱性—两性与等电点（1）两性氨基酸在一般情况下不是以游离的羧基或氨基存在的，而是两性电离，在固态或水溶液中形成内盐。RCHCOOHNH2RCHCOONH3（2）等电点RCHCOOHNH3RCHCOONH3RCHCOONH2RCHCOOHNH2OHHOHH等电点：在氨基酸水溶液中加入酸或碱，至使羧基和氨基的离子化程度相等（即氨基酸分子所带电荷呈中性—处于等电状态）时溶液的pH值,常以pI表示。溶液pHpI等电点(pI)溶液pHpI注：a.等电点为电中性而不是中性，在溶液中加入电极时其电荷迁移为零。中性氨基酸pI=4.8~6.3酸性氨基酸pI=2.7~3.2碱性氨基酸pI=7.6~10.8b.等电点时，偶极离子在水中的溶解度最小，易结晶析出，可分离氨基酸混合物。2.与亚硝酸反应CHRCOOH+HNO2CHRCOOHNH2OHN2H2O++反应是定量完成的，定量放出N2，测定N2的体积便可计算出氨基酸中氨基的含量，此反应称为范斯莱克（vanSlyke)氨基测定法。RCHCOOHNH2+HCHORCHCOOHNCH2+H2O3.与甲醛反应4.络合性能CuNH2OH2NORROO用途：分离鉴定氨基酸蓝色结晶5.受热反应（1）-氨基酸：分子间失水生成哌嗪二酮的衍生物OHNH2HOH2NORRO+NHHNOORR+2H2O（2）-氨基酸：分子内脱氨生成,-不饱和酸RCHCH2COOHNH2RCH=CHCOOH+NH35.受热反应（3）,-氨基酸：分子内氨基与羧基失水生成内酰胺HNROHNRO-丁内酰胺-戊内酰胺（4）氨基与羧基距离更远：多个分子间氨基与羧基失水生成聚酰胺6.茚三酮反应•α-氨基酸在碱性溶液中与茚三酮作用，生成显紫红色的有色物质，是鉴别α-氨基酸的灵敏的方法。CCCOOOCCCOOOHOHH2OCCCOOOHOHRCHCOOHNH2+茚三酮水合茚三酮CCCOONCHCOOHRH2O-RCHOCCHCOONH2水合茚三酮CCHCOONCCCOOCCCONCCCOOOH紫色-CO27.失羧作用赖氨酸戊二胺异戊醇8.失羧和失氨作用15.2多肽1.肽和肽键•一分子氨基酸中的羧基与另一分子氨基酸分子的氨基脱水而形成的酰胺叫做肽，其形成的酰胺键称为肽键。NH2CHRCOOHNH2CHR'COOH+-H2ONH2CHRCONHCHR'COOH肽键15.2.1多肽的组成和命名由多个α-氨基酸缩合而成的肽称为多肽。一般把含100个以上氨基酸的多肽（有时是含50个以上）称为蛋白质。NH2CHRCONHCHR'CONHCHR''COOHnCN端端•无论肽链有多长，在链的两端一端有游离的氨基（-NH2），称为N-端；链的另一端有游离的羧基（-COOH），称为C-端。•依据氨基酸数目依次叫二肽，三肽，由多个α-氨基酸缩合而成的肽称为多肽。一般把含100个以上氨基酸的多肽（有时是含50个以上））称为蛋白质。2.肽的命名•以含C-端的氨基酸为母体，把肽链中其它氨基酸名称中的酸字改为酰字，将含N-端的氨基酸写在最前面，根据氨基酸在肽链中的顺序称为某氨酰-某氨酰…某氨酸（简写为某-某-某）。•例如：很多多肽都采用俗名，如催产素、胰岛素等。15.2.2多肽结构的测定测定多肽结构需要解决的问题：①了解某一多肽是由哪些氨基酸组成的。②各种氨基酸的相对比例。③确定各氨基酸的排列顺序。HClH2O多肽氨基酸层析法分离各种氨基酸各种氨基酸的含量多肽结构测定工作步骤如下：1．测定分子量2．氨基酸的定量分析O2NFH2NCHRCONHCHR'CONH………+O2NHNCHRCONHCHR'CONH…NO2NO2Na2CO3HClO2NHNCHRCOOHNO2CHR'COOH+H2N+现代方法是将水解后的氨基酸混和液用氨基酸分析仪进行分离和测定3.端基分析（测定N-端和C-端）（1）测定N端（有两种方法）a.2,4-二硝基氟苯法—桑格尔(Sanger-英国人)法2,4-二硝基氟苯与氨基酸的N端氨基反应后，再水解，分离出N-二硝基苯基氨基酸，用色谱法分析，即可知道N-端为何氨基酸。O2NFH2NCHRCONHCHR'CONH………+O2NHNCHRCONHCHR'CONH…NO2NO2Na2CO3HClO2NHNCHRCOOHNO2CHR'COOH+H2N+测定咪唑衍生物的R，即可知是哪种氨基酸。异硫氰酸苯酯法的特点是，除多肽N端的氨基酸外，其余多肽链会保留下来。这样就可以继续不断的测定其N端。C6H5N=C=SNH2CHCONHR多肽+C6H5NHC多肽SNHCHRCONHpH7pH7CNCCHHNC6H5ORS+多肽b异硫氰酸苯酯(Ph-N=C=S)法——艾德曼(Edman)降解法。（2）测定C端a多肽与肼反应所有的肽键（酰胺）都与肼反应而断裂成酰肼，只有C端的氨基酸有游离的羧基，不会与肼反应成酰肼。这就是说与肼反应后仍具有游离羧基的氨基酸就是多肽C端的氨基酸。b羧肽酶水解法在羧肽酶催化下，多肽链中只有C端的氨基酸能逐个断裂下来。•4．肽链的选择性断裂及鉴定•上述测定多肽结构顺序的方法，对于分子量大的多肽是不适用的。对于大分子量多肽顺序的测定，是将其多肽用不同的蛋白酶进行部分水解，使之生成二肽、三肽等碎片，再用端基分析法分析个碎片的结构，最后将各碎片在排列顺序上比较并合并，即可推出多肽中氨基酸的顺序。•部分水解法常用的蛋白酶有：•胰蛋白酶——只水解羰基属于赖氨酸、精氨酸的肽键。•糜蛋白酶——水解羰基属于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的肽键。•溴化氰———只能断裂羰基属于蛋氨酸的肽键。•例：某八肽完全水解后，经分析氨基酸的组成为：丙、亮、赖、苯丙、脯、丝、酪、缬。•端基分析：N-端丙……………………亮C-端。•糜蛋白酶催化水解：分离得到酪氨酸，一种三肽和一种四肽。•用Edman降解分别测定三肽、四肽的顺序，结果为：丙-脯-苯丙；赖-丝-缬-亮。•由上述信息得知，八肽的顺序为：丙脯苯丙酪赖丝缬亮三肽四肽糜蛋白酶15.2.3多肽的合成1.保护-NH2(氯甲酸苄酯法,氯甲酸叔丁酯法)NH2CHRCOOHCNHOCHRCOOH+CH2OCClOCH2O氨基酸是多官能团化合物，在按要求形成肽键时，必须将两个官能团中的一个保护起来，留下一个去进行指定的反应，才能达到合成的目的。对保护基的要求是：易引入，之后又易除去。2.活化反应基团（活化-COOH）H2NCHCOOHCNHOCHRCOClCH2OCNHOCHRCOOHCH2ORCNHOCHRCCH2ONHCHCOOHR'OH2/PtH2NCHRCCH3NHCHCOR'O+CO2+SOCl2多肽15.3蛋白质蛋白质：分子量在10000以上，构型复杂的多肽称为蛋白质1.蛋白质的分类（1）根据形状分：a.纤维蛋白质如丝蛋白、角蛋白等；b.球状蛋白质如蛋清蛋白、酪蛋白、血红蛋白等。（2）根据组成分：a.单纯蛋白质—其水解最终产物是α-氨基酸。b.结合蛋白质—α-氨基酸+非蛋白质（辅基）辅基为糖时称为糖蛋白；辅基为核酸时称为核蛋辅基为血红素时称为血红素蛋白等。（3）根据蛋白质的功能分:a.活性蛋白按生理作用不同又可分为；酶、激素、抗体、收缩蛋白、运输蛋白等。b.非活性蛋白担任生物的保护或支持作用的蛋白，但本身不具有生物活性的物质。例如：贮存蛋白（清蛋白、酪蛋白等），结构蛋白（角蛋白、弹性蛋白胶原等）等等。2.蛋白质的一级结构牛胰岛素的一级结构牛胰岛素是有A和B两条多肽链共51个氨基酸组成。A链含有11种共21个氨基酸残基，N-端为甘氨酸，C-端为天冬酰胺；B-链含有16种共30个氨基酸残基，N-端为苯丙氨酸，C-端为丙氨酸。A链和B链通过两条二硫键互相连接成胰岛素分子，其分子量大约为6000。蛋白质的一级结构：蛋白质分子中氨基酸的排列顺序3.蛋白质分子中维持构象的次级键a.氢键；b.离子键；c.疏水键；d.二硫键4.蛋白质的二级结构螺旋间隔α-螺旋二级结构：多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性的结构的构象，是多肽链局部的空间结构（构象），主要有α－螺旋、β－折叠、β－转角等几种形式其中以α－螺旋最为常见。5.蛋白质的三级结构肌红蛋白的三级结构三级结构：一条多肽链在二级结构的基础上，进一步盘绕，折叠，从而产生特定的空间结构6.蛋白质的四级结构血红蛋白分子的四级结构四级结构：是指各具独立三级结构多肽链再以各自特定形式接触排布后，结集所形成的蛋白质最高层次空间结构。在此蛋白质四级结构中，各具独立三级结构的多肽链称亚基。7.蛋白质的两性电离和等电点8.蛋白质的沉淀1.盐析向蛋白质溶液加入一定浓度的中性盐[如(NH4)SO4、Na2SO4、NaCl等]，使蛋白质发生沉淀的作用称盐析。2.加脱水剂当向蛋白质溶液中加入甲醇、乙醇或丙酮等极性有机溶剂，由于这些有机溶剂与水的亲合力较大，能破坏蛋白质分子的水化膜以及降低溶液的介电常数从而增加蛋白质分子相互间的作用，使蛋白质凝聚而沉淀。人血清白蛋白pI:4.649.蛋白质的变性•天然蛋白质因受物理或化学因素的影响，改变了蛋白质分子的内部结构，从而导致蛋白质生物活性和理化性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。•蛋白质的变性按性质和程度的不同，可分为可逆变性和不可逆变性两种类型。蛋白质变性后如分子结构改变不大(如改变至三级结构)，可重新恢复原来性质的，称为可逆变性。变性后如分子结构改变较大时(如改变至二级结构)，就不易恢复原有性质，称为不可逆变性。•物理因素如加热、紫外线照射、X-射线、超声波、剧烈振荡和搅拌等，化学因素如强酸、强碱、尿素、重金属盐、三氯乙酸、乙醇、丙酮等的作用，都能引起蛋白质变性。•蛋白质分子量很大，其分子颗粒的直径一般在1～100nm之间，位于胶体质点的范围，所以具有胶体溶液的特征，如布朗运动、丁泽尔现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具有吸附性质等。•蛋白质分子中的氨基酸带有某些特殊的侧链基团，便可和某种试剂产生特殊的颜色反应，利用这些反应可以鉴别蛋白质。作业p2963,