第十四章基因重组和基因工程

第十四章基因重组和基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering一、DNA的重组(DNArecombination)：DNA重组的类型：接合(conjugation)、转化(transformation)和转导(transduction)的基本概念；特异位点重组(site-specigicrecombination)和转座重组(transposition)。2学时二、重组DNA技术：DNA克隆(DNAcloning)、工具酶、目的基因(targetDNA)、基因载体(cloningvector)；重组DNA技术基本原理及操作步骤。3学时三、简介重组DNA技术与医学的关系。1学时总学时：6学时一、DNA的重组（DNARecombination）DNA重组的类型：同源重组(homologousrecombination)、接合(conjugation)、转化(transformation)、转导(transduction)特异位点重组(site-specigicrecombination)和转座重组(transposition)。（一）同源重组发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。Homologousrecombination（同源重组）:RecombinationbetweentwoDNAmoleculesofsimilarsequence,occurringinallcells.以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤：1．两个同源染色体DNA排列整齐2．一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体3．通过分支移动产生异源双链DNA4．Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体(splicerecombinant)：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。（二）细菌的基因转移与重组1．接合作用：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。2．转化作用：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。Transformation:IntroductionofanexogenousDNAintoacell,causingthecelltoacquireanewphenotype.3．转导作用：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。Transduction:Thetransferofgeneticinformationfromonecelltoanotherbymeansofaviralvector.（三）位点特异重组位点特异重组(site-specificrecombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。Site-specificrecombination:Atypeofgeneticrecombinationthatoccursonlyatspecificsequences.（四）转座重组：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。Transposition:Themovementofageneorsetofgenesfromonesiteinthegenometoanother.1．插入序列转座：插入序列(insertionsequences,IS)组成：二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列，特有的正向重复序列。发生形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)2．转座子转座：转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。Transposon(transposableelement):AsegmentofDNAthatcanmovefromonepositioninthegenometoanother.转座子组成：反向重复序列；转座酶编码基因；抗生素抗性等有用的基因。二、重组DNA技术（RecombinationTechnique）（一）DNA克隆：克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。DNAcloning:RecombinantDNAtechniqueinwhichspecificcDNAsorfragmentsofgenomicDNAareinsertedintoacloningvector,whichthenisincorporatedintoculturedhostcells(e.g.,E.colicells)andmaintainedduringgrowthofthehostcells;alsocalledgenecloning.生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程(geneticengineering)—实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②
获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）（二）工具酶：限制性核酸内切酶；DNA聚合酶Ⅰ；逆转录酶；T4DNA连接酶；碱性磷酸酶；末端转移酶；TaqDNA聚合酶。1．限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）。作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。Ⅱ类酶识别序列特点—回文结构(palindrome)。切口：平端切口、粘端切口同功异源酶：来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。（三）目的基因1．cDNA(complementaryDNA)2．基因组DNA(genomicDNA)（四）基因载体定义-为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体--质粒DNA；噬菌体DNA；病毒DNA。克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。Cloningvector:AnautonomouslyreplicatinggeneticelementusedtocarryacDNAorfragmentofgenomicDNAintoahostcellforthepurposeofgenecloning.Commonlyusedvectorsarebacterialplasmidsandmodifiedbacteriophagegenomes.表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。Expressionvector:AmodifiedplasmidorvirusthatcarriesageneorcDNAintoasuitablehostcellandtheredirectssynthesisoftheencodedprotein.SomeexpressionvectorsaredesignedforscreeningDNAlibrariesforageneofinterest;others,forproducinglargeamountsofaproteinfromitsclonedgene.1.质粒(plasmid)：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。2.噬菌体(phage)：3.粘性质粒(cosmid)：4．其他：酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)；细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)；动物病毒DNA改造的载体：如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒。（五）重组DNA技术基本原理目的基因的获取，克隆载体的选择和构建，外源基因与载体的连接，DNA导入受体菌，重组体的筛选，克隆基因的表达。1．目的基因的获取：（1）.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。（2）.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)（3）.cDNA文库(cDNAlibrary)（4）.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)2．克隆载体的选择和构建：3．外源基因与载体的连接：1.）粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接；(2)不同限制酶切位点连接：配伍末端连接；非配伍末端连接。2.）平端连接：适用于：限制性内切酶切割产生的平端；粘端补齐或切平形成的平端。3.）同聚物加尾连接：在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。4.）人工接头(linker)连接：由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。4．重组DNA导入受体菌受体菌条件：安全宿主菌；限制酶和重组酶缺陷；处于感受态(competent)。导入方式：转化(transformation)；转染(transfection)；感染(infection)5．重组体的筛选1.）直接选择法：(1)抗药性标记选择；(2)标志补救(markerrescue)；(3)分子杂交法。原位杂交；Southern印迹。2.）免疫学方法：如免疫化学方法及酶免检测分析等小结重组DNA技术操作过程可形象归纳为：分-----分离目的基因切-----限制酶切目的基因与载体接-----拼接重组体转-----转入受体菌筛-----筛选重组体6．克隆基因的表达表达体系的建立；表达载体的构建；受体细胞的建立；表达产物的分离纯化。1.）原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)很难表达大量可溶性蛋白2.）真核表达体系酵母、昆虫、乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA；可适当修饰表达的蛋白质；表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济。转染——将表达载体导入真核细胞的过程：方法：磷酸钙转染；DEAE葡聚糖介导转染；电穿孔；脂质体转染；显微注射。三、重组技术与医学的关系（一）疾病基因的发现与克隆根据基因