第十四章液相色谱-质谱联用

114.3液相色谱-质谱联用分析法14.3HyphenatedTechnologyofHPLC-MS★液相色谱—质谱联用（LC—MS联用）2对于热稳定性差、不易汽化的样品，GS—MS联用有一定的困难。因此，近年来又发展了液相色谱—质谱联用技术。LC分离要使用大量的液态流动相，如何有效地除去流动相而不损失样品，是LC—MS联用的难题之一。目前应用较多的有两种接口装置。LC-MS用传送带联接装置3一、高效液相色谱-质谱联用仪二、离子源三、质量分析器四、串联四级质谱法的扫描方式和模式五、检测器和真空泵六、LC-MS分离条件的选择和优化七、注意事项见建议4一、液相色谱-质谱联用仪1.液质联用仪组成流程5气相色谱-质谱联用（GC/MS）高效液相色谱-质谱联用（HPLC/MS）；也可以质谱-质谱联用（MS-MS）。基于色谱和质谱的仪器灵敏度相当，加之使分离效果好的色谱成为质谱的进样器，而速度快、分离好、应用广的质谱仪作为色谱的鉴定器，使它们成为目前最好的用于分析微量的有机混合物的仪器。一、液相色谱-质谱联用仪2.液质联用仪类型6气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图液质联用与气质联用的区别:7LC-MS联用仪系统构成8广适性检测系统3.液质联用的优势一、液相色谱-质谱联用仪9分析热不稳定化合物分析气相色谱-质谱无法分析的样品分析大分子量的化合物，如生化样品极高的灵敏度10进一步增加HPLC的分离能力114.LC-MS联用中的转变过程液相色谱的现实情况：从高效液相色谱流出的化合物存在于大气压条件下的溶液之中质谱的现实情况：在高真空工作条件下的质谱仅接受气相的离子:因此，液质联用的接口必须完成:带电状态:“中性”-离子物态转变：液态-气态真空变化:760torr-10-510-8torr。从LC-MS转变LC-MS转变过程去除溶剂保留样品电离化合物12接口13API接口：Z-Spray接口14二、离子源大气压电离(API)技术目前，LC-MS采用大气压离子化（Atmosphericpressureionization,API)技术作为液质联用的接口技术，也是质谱离子化技术。API主要包括：电喷雾electrosprayionization,ESI大气压化学电离atmosphericpressurechemicalionization,APCI离子源：使样品产生离子的装置叫离子源。15（一）电喷雾离子源ESI（二）大气压化学电离APCI（三）ESI与APCI比较二、离子源161.电喷雾离子化ESI接口2.电喷雾离子化ESI特征3.电喷雾离子化ESI过程4.影响化合物ESI电离的因素（一）电喷雾离子化ESI171.ESI接口（一）电喷雾离子源氮气用来做去溶剂气和锥孔气氩气做碰撞气先形成带点电荷18低分子量化合物一般产生单电荷离子(失去或得到一个质子)高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子几乎没有碎片离子可能生成加合物和/或多聚体;常见的是溶剂加合物和NH4+(M+18),Na+(M+23),和K+(M+39)加合物灵敏度取决于化合物本身和基质（一）电喷雾离子源2.ESI特征19（1）形成带电小液滴（2）溶剂蒸发和小液滴碎裂（3）最终形成气相离子3.电喷雾离子化ESI过程（一）电喷雾离子源20（1）形成带点离子3.电喷雾离子化ESI过程2122（2）溶剂蒸发和小液滴碎裂3.电喷雾离子化ESI过程23（3）形成气相离子对于半径10nm的液滴,电荷的排斥作用导致离子从液滴表面蒸发而不是液滴的分裂。离子从溶液中转移至气相3.电喷雾离子化ESI过程244.ESI-MS的基本离子化原理是：溶剂由液相泵输送到ESI毛细管，经其内的不锈钢毛细管流出，在ESI高压电极处施以负的高电压,小液滴从毛细管高速喷出而带有过量的负电荷.从而产生电化学反应：通过溶剂组分氧化而去掉正离子或通过毛细管自身的氧化而增加负离子。在高温和氮气的吹扫下，溶剂逐渐挥发，变成小颗粒的液滴，由于高电场作用，极性溶质成为带电离子溶解在溶剂液滴上，当溶剂颗粒逐渐减小，小到一定程度，带电的溶质粒子便从液滴表面蒸发出来，形成带电离子，完成离子化25（4）影响化合物ESI电离的因素(a）化合物的浓度(b）基质的性质(c)化合物的表面活性(d)流速26离子的释放取决于浓度.•信号在10μM时达到饱和.•线性动态范围限制在2-3个数量级信号的饱和归因于离子在液滴表面过于密集,致使某些样品离子不能到达液滴表面.ESI:样品浓度对其响应的影响2728ESI:基质对样品响应的影响一般而言,样品信号强度响应随着其它电解质浓度的增高而降低;这一现象叫作‘离子抑制。样品离子和电解质离子对电荷及占据液滴表面的竞争导致离子抑制。表面竞争电荷竞争29基质选择一般原则一般而言，对于正离子检测模式，样品必须比基质更具碱性，以便形成(M+H)+或足够的极性去形成稳定的加和离子，例(M+NH4)+。对于负离子检测模式，样品必须比基质更具酸性，以便形成(M-H)-或足够的极性去形成稳定的加和离子，例如(M+OAc)-。ESI:基质对样品响应的影响30ESI:流速对样品响应的影响ESI响应随流速的增加而降低对ESI接口来说,最佳工作流速为100-250μL/min.311.大气压化学电离源APCI接口2.大气压化学电离源APCI特征3.大气压化学电离源过程(二）大气压化学电离源APCI32（二）大气压化学电离源APCI1.APCI接口雾化332.大气压化学电离源APCI特征一般而言,只生成单电荷离子几乎没有碎片离子可能生成加合物和/或多聚体;一般是溶剂加合物及NH4+(M+18),Na+(M+23),和K+(M+39)加合物基质影响较小(相对于ESI)。质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的影响343.大气化学电离过程大气压化学电离可分为以下两个步骤:（1）快速蒸发（2）气相化学电离(电晕放电)35（1）快速蒸发液流被强迫通过一根窄的管路以使其得到高的线速度高温加热器和喷雾器使液流在脱离管路时蒸发成气体由于溶剂蒸汽的保护，样品分子较少受热裂解的影响，大量的热量用于溶剂的蒸发，但是有时也会有热不稳定样品分解36（2）气相化学电离37Needle喷雾针（CoronaNeedle电晕针reagentgas试剂气离子-分子反应2.大气压化学电离源APCI38大气压化学电离源APCI离子-分子反应质子转移电子捕获电荷交换离子加和适合于热稳定、易气化的小分子低极性化合物39（三）ESI与APCI的比较共同点都属于大气压电离法（API）通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子都使用高电压元件和雾化气喷雾法产生气相离子产生极少的碎片，但可以控制产生结构碎片40ESI与APCI的比较不同点生成离子方式不同样品兼容性不同流速兼容性不同ESI：液相离子化APCI：气相离子化ESI：0.2-0.5ml/minAPCI：0.5-1ml/minESI：极性化合物和生物大分子APCI：非极性,小分子化合物(相对于用ESI电离的化合物而言)且有一定的挥发性4142样品已经变成气相离子样品仍处于大气压下必须把样品送入质谱高真空环境中43蒸气通过样品锥孔进入一级真空区(离子源区)并且膨胀蒸气在膨胀时会冷却这种冷却可能导致在被分析物离子上的溶剂冻结从而生成各种质量数的簇离子一级真空成簇过程簇离子会降低所要检测的被分析物质量处的信号；簇离子会增加背景信号44加热一级真空区(离子源区)以阻止簇离子的生成,使不带溶剂的样品离子被检测在通过加热的离子源区以后,样品离子在静电场作用下通过萃取锥孔通过萃取锥孔后,样品离子进入六极杆聚焦透镜从六极杆聚焦透镜出来,样品离子进入四极杆质量分析器45三.质量分析器双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector).四极质谱仪(Q).飞行时间质谱仪(TOF).离子阱质谱仪（TRAP）┏四极+TOF（Q-TOF）串列式多级质谱仪┫三重四极（QqQ）(MS/MS)┗TOF+TOF1.分类46单四极杆分析器Quadrupole由四根棒状电极组成直流电压：DC射频电压：RF形成二维四极电场离子在场的作用下产生振动，碰到四极杆而被吸收通过四极杆的离子到达检测器被检测2.四级杆分析器4748通过改变RF，从而改变通过的离子质量离子质量时间扫描循环时间扫描时间回程时间程序处理时间49串联质量分析器空间串联时间串联空间-时间串联四极杆串联Q-Q-Q离子阱FTICRQ-Trap都有碰撞活化室50实验室现有的质量分析器类型：串联四极质谱仪(MS/MS)：三重四极（QqQ）离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器MS1MS2Q1q2Q3第一级质量分析器：用于选择一个前体离子或母离子，然后，用适当的活化方法是这一离子裂解成产物离子或称子离子及中性碎片。mp+mf++mnmp+为前体离子；mf+为产物离子；mn为中性碎片；第二级质量分析器：用于产物离子分析如从产物中再选择一个离子，分析最后选择的离子的碎片，则标记MS/MS/MS，数级可进一步增加至n次，实现MSn实验51串联质量分析器三重四极杆三个四极杆串联Q-Q-QQ1–质量分离Q2–碰撞活化CIDCollision-InducedDissociationQ3–质量分离523.碰撞诱导解离CID质谱QqQ检测器中的碰撞反应在CID中进行。选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气体(本实验室选择高纯氦)，发生离子—分子碰撞反应，从而产生‘子离子’，再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱，一般称做CID(collision-induceddissociation)谱。53CID产生的过程544.影响CID质谱的因素：较大影响的因素有：所用碰撞气体的种类，压力，离子的能量，仪器的配置以及离子电荷状态由于在不同的仪器上不可能在完全相同的条件下去分析样品，任何一个给定的化合物将在不同的条件下给出差别或大或小的质谱，尤其是各个离子峰的相对丰度的差别几乎是无法避免的。因而目前尚难以建立商品化的谱库供检索使用，只能进行人工解析或自己建库。大气压电离技术中产生的离子为偶数电子离子，其主要的碎片应由化学键的诱导断裂和重排反应来产生，所以在EI质谱解析中总结出的偶数电子离子的开裂规则一般可适用于CID质谱的解释。55四、扫描方式和扫描模式全扫描(FullScan)子离子扫描(DaughterScan)母离子扫描(ParentScan)中性碎片丢失扫描(ConstantNeutralLossScan)选择离子监测(SIR)多反应监测(MRM)（一）扫描方式（二）扫描模式正离子模式负离子模式561、全扫描特征：–质谱扫描得到一段质量范围从而获得质谱图–用于未知物的结构分析–用于SIR方法的开发以及MRM方法开发寻找母离子最佳电离参数Q3Q2Q1=scanned=CID=selectedm/z定性寻找总分子离子峰出峰时间57LC-MS中常见的本底离子m/z50-150,溶剂离子，[(H2O)nH+，n=3-112]m/z102,H+乙腈+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549m/z149,管路中邻苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233m/z288,2mm离心管的产生的特征离子m/z279,管路中邻苯二甲酸二丁酯C16H22O4H+,279.1591m/z316,2mm离心管的产生的特征离子m/z384,瓶的光稳定剂产生的离子m/z391,