第十章酶的定向进化

第十章酶的定向进化(Directedevolution)第一节酶定向进化简介第二节酶分子定向进化的历史第三节定向进化的选择策略第四节定向进化的应用第一节定向进化简介一、自然进化与定向进化二、理论来源三、概念一、自然进化与定向进化达尔文在《物种起源》中提出以自然选择为基础的进化学说，成为生物学史上的一个转折点。1、自然进化（1）环境压力下物种朝着适应生存环境的方向发展；（2）漫长时间里通过DNA复制发生突变或通过重组，产生了遗传多样性；（3）自发、非常缓慢、自然选择；2、定向进化是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。人为引发、较短时间、人为选择。3、定向进化的一般过程细菌诱变500C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C4、酶定向进化的意义酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。二、理论来源利用基因工程原理在实验室中模拟生物进化过程待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。化学进化生物进化是蛋白质工程的新策略主要是利用分子生物学手段，在分子水平创造分子的多样性，在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。是一种在生物体体外快速模拟达尔文进化的、具有一定目的性和快速改造蛋白质的方法，相对于传统的蛋白质的“理性设计”，酶的分子定向进化属于蛋白质的非合理设计。三、定向进化概念定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）定向进化的过程（1）通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性；（2）导入适当载体后构建突变文库；（3）通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。20世纪60年代利用RNA噬菌体进行实验，是第一次在分子水平上定向改造单一分子。SolSpiegelman第二节酶分子定向进化的历史1981年，B.G.Hall等定向改变E.coliK12中ebg酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。1993年，Arnold研究组提出易错PCR的方法。1994年，Stemmer将DNA重组方法引用到酶分子的定向进化中。1999年，Stemmer等把DNA改组延伸到族改组。第三节定向进化的选择策略随机突变策略易错PCR、DNA改组和外显子改组、体外随机引发重组、交错延伸、定位诱变筛选——采用回交法1、易错PCR(error-pronePCR)通过改变PCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。控制DNA的突变频率。不足之处：靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围有限；中性突变较多；且较为耗时、费力；获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。此法突变具有一定的密码偏向性。连续易错PCR(Sequentialerror-pronePCR)将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。2、DNA改组1994年，Stemmer在Nature发表了一篇题为《RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling》的文章，首次提出了DNA改组(DNAshuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试验对象，用DNA改组，经过三轮筛选和两次回交得到一新菌株，其头孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制浓度比原始菌株提高了32,000倍，也远高于易错PCR的突变筛选结果。DNA改组是DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。是一种分子水平上的定向进化。因此也称为分子育种。DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此，灵敏可靠的筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。DNA改组原理1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸反复重复步后，可获得全长DNA片段2-4。DNA改组步骤：（1）目的DNA片段的获得；（2）目的基因的随机片段化，即将目的基因（可以是单个基因或一组相关基因）酶切成随机片段，这些随机片段集合包含了来自不同的同源序列的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同的3’末端；（3）无引物PCR，具有互补3’末端的寡核苷酸互为引物，各为模板，通过不断的PCR循环，在不同模板上随机互补进一步延伸；（4）有引物PCR，以上轮无引物PCR的产物为模板，加入基因两端序列为引物，经过多轮PCR得到重排产物的集合为突变文库；（5）克隆、筛选、分析及多轮筛选，即进一步对突变文库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮改组的模板，重复上述步骤进行多次重排和筛选，最终获得性状比较理想的突变体。单个DNA改组技术原理示意图(a)单个基因（b)基因家族改组技术(familyshuffling)Crameri等于1998年首次提出“DNA家族改组”的概念。他们发现，采用传统的DNA改组方法虽然能完成定向进化的目的，但其中随机产生的多为点突变，且有益突变频率低，导致筛选工作艰巨且进展缓慢。DNA家族改组是以来自不同种属的同源基因作为重排对象进行DNA改组操作的技术。该技术打破不同种、属间的遗传界限,利用同源基因之间的同源序列进行DNA改组。特点：显著加速有益突变的累积，易于实现目的蛋白多种特性的共进化。1、需要有一个含有各种不同正突变的基因组库(例如:通过经典的诱变育种得到目的性状发生改进的不同的正突变菌株，就构成了所需的基因组库)；2、通过原生质体融合将这些正突变菌株的全基因组进行随机重组；3、筛选目的性状得到进一步改进的菌株来进行下一轮基因组改组；4、循环多轮随机重组。与常规突变技术相比，DNA改组有以下显著优点：①DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb；②通过多轮筛选或选择，可使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；③DNA改组从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序；④DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率。研究表明，DNA改组比随机突变具有较大的优势，随机突变的方法一般产生1%的良性突变，但DNA改组可产生13%的良性突变。DNA改组与常规定向进化的比较3、体外随机引发重组法(random-priminginvitrorecombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。反复进行上述过程，直到获得满意的进化酶性质。该法优于DNA改组法的特点在于:(1)RPR可以利用单链DNA为模板，可10~20倍地降低亲本DNA量；(2)在DNA改组中，片段重新组装前必须彻底除去；DNaseⅠ，故RPR方法更简单;(3)合成的随机引物具有同样长度，无顺序倾向性。在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变；(4)随机引发的DNA合成不受DNA模板长度的限制。4、交错延伸方法：PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步，缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。反复进行，直到产生完整的基因长度，结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。特点：重组发生在单一试管中，不需分离亲本DNA和产生的重组DNA。第四节定向进化的应用一、提高酶分子的催化活力二、提高酶分子的稳定性三、提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化五、对映体选择性的定向进化一、提高酶分子的催化活力酶活的高低反映一个生物催化与转化过程反应速率的快慢，酶活越高，反应速率越快，反之则反应速率越慢。因此，实现较高的酶活是企业一直追求的目标。L—天冬氨酸酶定向进化研究进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶二、提高酶分子的稳定性酶的稳定性对以酶为催化剂的有机合成非常重要，催化反应发生在水相也是如此。在有机合成过程中，作为生物催化剂的酶所处的真实条件同其进化的自然环境通常差异显著，特别是在高温、极端pH和非水相体系中进行的催化反应更加要求提高酶的稳定性和活力。1、热稳定性T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4℃.8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2℃2、pH稳定性不同的酶有其不同的最适pH范围，当反应体系的pH值达到其最适条件时，酶将发挥其最佳的催化效率，但当反应体系的pH不适宜时，酶的催化效率就会有所降低，在极端的pH条件下，甚至会失去活性。3、非水相的稳定性有机化学合成中酶的开发与应用越来越引起人们的重视，酶在非水相中的催化反应在各领域得到了广泛应用，已成为酶学研究的主要内容之一。三、提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化不同的酶具有不同的底物特异性，底物特异性的高低直接影响到底物与酶的结合效率，并进一步影响整个催化过程的反应速率。Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了9倍Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功四、对映体选择性的定向进化对映体选择催化剂分子定向进化的概念是在2001-2002年间提出的，而首次应用于实验室研究是在2006年(ReetzandWang,2007)。利用酶的分子定向进化提高生物催化剂的对映体选择性是解决手性物质光学纯度低的一个潜有力的方法。S型选择性的转氨酶转化ß-丁酮，仅有65%的手性专一性。通过10000个随机突变的菌株的筛选，获得10个手性专一性在80%-94%之间的酶。