第四章食品微生物检验样品的制备.

第四章食品微生物检验样品的制备样品的采集和制备是食品微生物检验的重要组成部分。用于检验的样品数量和状况具有重要意义，因为对整批食品的判定是以这批样品的检验结果为依据的。如果样品的采取、运送、保存或制备过程中操作不当，或者样品不具备代表性，就会使实验的微生物检验结果毫无意义。这就对取样人员和制样人员提出了很高的专业要求，既要保证样品的代表性和一致性，又要保证整个微生物检验过程在无菌操作的条件下进行。1、了解微生物检验的采样原则；2、掌握检验的基本程序和样品的采集及处理方法；3、掌握食品微生物检验中常见检验的制备技术，写出正确的检验结果，写出规范的检验报告。第一节食品微生物检验技术样品的采集与处理方法•一、样品采集•通过长期的实践工作经验和科学的试验表明，用于食品微生物检验的样品的采集主要应该遵循以下原则：•1、必须保证整个样品的采取和制备过程是无菌操作；•2、取样要讲究方法、有代表性，不同的样品有不同的要求，特别是某些特殊食品；•3、样品的包装密封和标志要明确；•4、样品的运输、接收和保存要保持样品原样，不能影响样品的质量。•(一)、水样的采取•(二)、空气样品的采集•1、直接沉降法•2、过滤法•3、气流撞击法•（三）、生产工具样品的采集•1、表面擦拭法•2、冲洗法二、样品的送检•1、取样结束后应尽快将样品送往实验室检验。•2、取样人及时写出完整的取样报告。•3、为保证样品的完整性，装有样品的包装物应进行封口，以证实其可靠性。•4、样品应进行必要的清晰的标记。•5、样品在送检过程中必须有适当的保护措施(如密封、冷藏等)，以保证样品的微生物指标不发生变化。•6、如不能由专人携带送样时，也可托运。•7、做好样品送检记录，写明送检条件、日期、到达地点及其他需要说明的情况，并由送检人签字。•8、运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又回流瓶中，从而增加污染。三、样品的处理•（一）、样品接收时的处理•（二）、样品检验时处理方法四、检验与报告•（一）、检验•微生物检验主要是检查细菌和病毒等在食品中的数量或它们对实验动物的致毒、致病能力。制备好的检样，按不同的检验项目及时进行检验。食品微生物检验按国标检验方法规定。主要检验项目菌落总数、大肠菌群、致病菌。•（二）、报告•按检验项目完成各类检验后，检验人员应及时填写检验报告单，签名后送主管人员签字，加盖单位印章，以示生效，立即交食品卫生监督人员处理。•发出报告后样品的处理：•1、阴性样品：在发出报告可及时处理；•2、阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；•3、进口食品的阳性样品：要保存6个月才能处理。五、国际常见取样方案•（一）、ICMSF取样方案•1、ICMSF采样原则•国际食品微生物规范委员会（ICMSF)提出的采样基本原则，是根据以下几个因素来设定抽样方案并规定其不同采用数的。•（1）、各种微生物本身对人的危害程度各不相同。•（2）、食品景经不同条件处理后，其危害变化情况：降低危害度、危害度未变、增肌危害度。目前，加拿大、以色列等很多国家以采用此法作为国家标准。•2、ICMSF采样方法•对一批产品检查多少检样，才能够有代表性，才能客观的反映出该产品的质量。为了强调抽样与检样之间的关系，ICMSF已经阐述了把严格的抽样计划与食品危害程度相联系的概念（ICMSF,1986)。另外，ICMSF将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等、严重三档。根据以上危害度的分类，有将取样方案分成二级法和三级法。•ICMSF方法中的二级法只设有n、c及m值，三级法则有n、c、m及M值。其中n代表一批产品采样个数；c代表该产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数；m表示合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开；M表示附加条件，判定为合格菌数的限量，表示边缘的课接受数与边缘的不可接受数之间的界限。•（1）、二级法设定取样数n，指标值m，超过指标值的样品数为c只要C0，就判定该批产品不合格。以生食海产品鱼为例，n=5，c=0，m=102，n=5即抽样5个，c=o即意味着在该批检样中未见到有超过m值得检样，此批货物为合格品。•（2）、三级法设定取样数n，指标值m，附加指标值M，介于m与M之间的样品数c。超过m值的检样即算为不合格；如果在c值范围内，即为附加条件值合格，超过M值者，则为不合格。例如生虾的细菌数标准n=5，c≦3，m=101，M=102，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许=3个检样的菌数是在m与M值之间，如果有3个以上检样的菌数是在m与M值之间或一个检样菌数超过M值者，则判定该产品为不合格品。•（二）、美国FDA取样方案美国食品及药品管理局（FDA)的取样方案与ICMSF的取样基本一致，所不同的是严重指标菌所取的15、30、60个样可以分别混合，混合的样品量最大不超过375g。也就是说所取得样品每个为100g，从中取出25g，然后将15个25g混合成一个375g样品，混匀后在取25g作为试样检验剩余样品妥善保存备查。各类食品检验时的混合样品的最低数量如下。食品危害度混合样品的最低数Ⅰ4Ⅱ2Ⅲ1•（三）、联合国粮食与农业组织（FAO)规定的取样方案1979年版食品与营养报告中的食品质量控制的微生物分析列举了各种食品的微生物限量标准，由于是按ICMSF的取样方案判定的所以在此引。第二节食品微生物检验中常见检样的制备•一、食品取样的准备工作•（一）、取样准备工作•1、取样计划的制定原则。食品检验的特点是以一小份样品的检验结果来评判一大批食品的质量，因此，样品的代表性至关重要。要保证样品的代表性，首先要有一套科学的取样方案，其次使用正确的取样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。一般说来，进出口贸易合同对食品取样量有明确规定的，按合同规定取样；进出口贸易合同没有具体取样规定的，根据以上原则确定取样方案。•2、取样计划的类型。取样计划的类型一般分为非随机取样计划和随机取样计划。工作人员通常希望通过随机取样获得样品。另外，当整批食品贮存条件相同，采用随机取样比较合理。在现场取样时，可利用随机取样表进行随机取样。随机取样表系用计算机随机编制而成。随机取样一般分为简单随机取样、分层随机取样、整群取样、系统取样和混合取样。•3、取样标准。目前国内外关于取样的标准很多，但无论哪种标准都只有一个目标：即获得具有代表性的样品，并通过对样品的检测得到能够代表整批产品的检验结果。取样时应根据不同的产品类型、产品状态等选择不同的取样方法和标准。（二）、取样要求•1、在取样之前应确认货、证是否相符。•2、取样过程中应避免雨水等环境的不良因素影响，防止样品被污染。•3、取样用具(如注射器、采血管、试管、探子、铲子、匙、取样器、剪子、样品袋等)必须是经过灭菌的。•4、对采集的样品一般要求随机取样。若怀疑最有可能受病原体污染或者带有病原体的样品，可以进行选择取样。•5、根据样品种类(如盒装、袋装、瓶装和罐装)，应取完整密封的样品。如果样品很大，则需用无菌取样器取样；若样品是粉末，应边取边混合；若样品是液体的，通过振摇即可混匀；若样品是冷冻的，应保持冷冻状态(可放在冰内、冰箱的冷盒内或低温冰箱内保存)，而非冷冻动物产品须保持在0～5℃保存。•6、取样前或取样后应在盛装样品的容器或样品袋上立即贴上标签，每件样品必须标记清楚(包括品名、来源、数量、取样地点、取样人及取样日期)。•7、获取有关取样产品的信息：如样品名称、批量大小、包装类型、包装容器体积、生产线、产品编号或控制号、批量号、标签内容、包装破损状况、产品存放地点或建筑物的基本情况等。•8、当客户对所规定的取样程序有偏离、添加或删节的要求时，应详细记录这些要求和相关的取样资料，并记人包含检测结果的所有文件中，同时告知相关人员。•9、当取样作为检测一部分时，实验室应有程序记录与取样有关的资料和操作。这些记录应包括所有的取样程序、取样人员的识别、环境备件(如果相关)、必要时有抽样地点的图示或其他等效方法，如果合适，还应包括取样程序所依据的统计方法。（三）、食品的取样点食品的取样计划中常包括以下取样点：原料、生产线(半成品、环境)、成品、库存样品、零售商店或批发市场、进口或出口口岸。•1、原料的取样。包括食品生产所用的原始材料、添加剂、辅助材料及生产用水等。•2、生产线取样。是指食品生产过程中不同加工环节所取的样品，包括半成品、加工台面、与被加工食品接触的仪器以及操作器具等。生产线样品的采集能够确定细菌污染的来源，可用于食品加工企业对产品加工过程卫生状况的了解和控制，同时能够用于特定产品生产环节中关键控制点的确定和HACCP的验证工作。另外还可以配合生产加工，生产前后或生产过程中对环境样品(如地面、墙壁、天花板以及空气等)取样进行检验，以检测加工环境的卫生状况。•3、库存样品的取样检验可以测定产品在保持期内微生物的变化情况，同时也可以间接对产品的保质期是否合理进行验证。•4、零售商店或批发市场的样品。检测结果能够反映产品在流通过程中微生物的变化情况，能够对改进产品的加工工艺起到反馈作用。•5、进口或出口样品。通常是按照进出口商所签订的合同进行取样和检测的。但要特别注意的是，进出口食品的微生物指标除满足进出口合同或信用证条款的要求外，还必须符合进口围的相关法律规定。二、常见检样的制备•实验室样品的制备是微生物检验的重要环节，是获得较高准确性和良好检验结果的基础。这里主要结合相关国际惯例，介绍微生物样品制备的要求。•由于食品种类繁多，在实际微生物检验中尽可能采用统一的样品制备方法，但是，对于许多特殊产品来说，由于产品本身的物理状态(如干品、粘稠度高的产品等)、样品中抑制物质的存在(如大蒜制品、洋葱制品、咸鱼等)或酸性等原因，则需要采用特殊的样品制备方法。这些特殊的样品制备方法包括以下几种。•1、调整食品稀释样液的pH值至中性。•2、对于含高抑制物质(成分)的产品(如大蒜制品、洋葱制品等)或所含微生物受损的产品(如酸性食品、盐渍食品、干制食品等)，使用缓冲蛋白胨水或其他稀释液。•3、为使渗压休克最小化，对于低水分活度的食物，需要采取特殊复水程序。•4、调整适当温度和静置时间，以利于可可粉、明胶、奶粉等样品的悬浮。•5、对于来自食物加工或贮存过程中的受损微生物，需要采取特殊复苏程序。•6、某些产品(如谷类)和(或)目标菌(如酵母菌和霉菌)和特殊均质程序及均质时间。•7、对于高脂肪食品，使用表面活性剂。•8、常用稀释液包括：0.85％生理盐水、缓冲蛋白胨水(BPW)、0.1％的蛋白胨水、磷酸盐缓冲溶液等。•样品制备常用器具包括：均质器及均质杯、拍打器及拍打袋、试管、刻度吸管、微量移液器、玻璃珠、检测天平、水浴锅、玻璃棒、酒精灯、镊子、刀子、电锯、托盘等。（一）、肉与肉制品样品的采集与制备•1、样品的采取•（1）、生肉及脏器检样•如是屠宰场后的畜肉，可于开腔后，用无菌刀采取两腿内侧肌肉各50g（或劈半后采取两侧背最长肌肉各50g）；如是冷藏或销售的生肉，可用无菌刀取腿肉或其他部位的肌肉100g。检样采取后放入无菌容器内，立即送检；如条件不许可时，最好不超过3h。送检时应注意冷藏，不得加入任何防腐剂。检样送往化验室应立即检验或放置冰箱暂存。•（2）、禽类（包括家禽和野禽）•鲜、冻家禽采取整只，放无菌容器内；带毛野禽可放清洁容器内，立即送检，以下处理要求同上述生肉。•（3）、各类熟肉制品•包括酱卤肉、肴肉、方圆腿、熟灌肠、熏烤肉、肉松、肉脯、肉干等，一般采取200g，熟禽采取整只，均放无菌容器内，立即送检，以下处理要求同上述生肉。•（4）、腊肠、香肚等生灌肠•采取整根、整只，小型的可采数根、数只，其总量不少于250g。2、检样的处理（1）、生肉及脏器检样的处理先将检样进行表面消毒（在沸水内烫3s~5s，或灼烧消毒），再用无菌剪子剪取检样深层肌肉25g，放入无菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀后即为1：10稀释液。（2）、鲜、冻家禽检样的处理先将检样进行表面消毒，用灭菌剪