第六章胚胎工程.

第六章动物人工繁殖胚胎工程技术试管动物试管婴儿首例万枚羊胚胎移植工程在锡盟启动1.2万枚澳大利亚多赛特和陶赛克绵羊的胚胎(受精卵)，在内蒙古锡盟乌拉盖草原的万余只母羊的子宫内“安家落户”。至此，世界上首例万枚优质种羊胚胎移植工程正式启动。此项工程是由香港屹昌科技集团和美国CCI集团完成，第一批投资0.89亿元人民币，总投资额高达10多亿元人民币。2001年春季，将有万余只澳州羊羔在中国出生。这将对整个中国西部畜牧业养殖结构的调整、养殖方式的改进、经营方法的转变及对草场的保护和生态环境的改变，都将产生十分深远的影响。动物人工繁殖有性生殖---体外受精、人工授精无性生殖---核移植一、胚胎工程简介1、定义：对哺乳动物的胚胎进行操作，让它继续发育获得人们所需要的成体动物的一种技术。主要包括：胚胎培养、胚胎移植、胚胎性别鉴定、胚胎分割与融合、胚胎保存等。试管动物（test-tubeanimal)定义：将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。体外受精（invitrofertilization,IVF)定义：是指使哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。揭示受精本质和机制研究胚胎分化和发育胚胎移植(embryotransfer,ET）定义：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵但未经配种的受体母畜输卵管或子宫的技术。这个来自供体的胚胎能够在受体的子宫着床，并继续生长和发育，最后产下供体的后代。2、发展历史1878年，德国人斯考克，以家兔、豚鼠为材料探索，未成功。1891年，英国剑桥大学的希普（WalterHop），世界上首例兔子受精卵移植成功的例子。1959年，美籍华人生物学家张明觉，世界首批试管动物，体外受精技术的建立。1982年，美国学者布拉吉特等培育出世界上第一个试管犊牛。3、试管动物繁殖的优点：发挥优良母畜的繁殖潜力----加快优良家畜品种的推广速度促进家畜改良的速度----繁殖能力的提高保存遗传资源----胚胎库的建立辅助技术----克隆动物、转基因动物、胚胎干细胞分离和性别控制等试管动物的培育流程（1）精子采集与体外获能，卵子采集与成熟培养。（2）体外受精。（3）重组胚激活与体外培养。（4）胚胎移植。（5）体内发育、发生。1、精子的采集与体外获能处理精子的形成精母细胞4个精细胞有活力精子的选择方法：“上浮分离法”精子获能：指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。精子获能的意义：不仅增强了精子活力，关键是去除了精子表面的覆盖物，暴露出精子膜和卵子的结合位点，使精子具有发生顶体反应的能力。当精子遇到卵子时，精子头部的顶体脱落，顶体酶释放，使卵子的放射冠和透明带溶解，精子进入卵细胞达到受精目的。自然状态下的精子获能宫颈、子宫、输卵管液中的酶水解糖蛋白等去能因子，使精子顶体酶活性恢复精子体外获能获能：钙离子肝素血清蛋白精细胞形成过程和卵细胞形成过程的异同1、在减数分裂第一次和第二次的后期，精细胞形成过程中细胞质是均等分裂的。而在卵细胞形成过程中，细胞质是不均等分裂的。2、形成的数目不同。一个精原细胞经过减数第一次分裂形成两个次级精母细胞，再经过减数第二次分裂共形成四个精细胞；而一个卵原细胞经过减数第一次分裂形成一个次级卵母细胞和一个极体，再经过减数第二次分裂只形成一个卵细胞，伴随形成三个极体（以后退化消失）。3、精细胞还要变形才能形成精子，而卵细胞没有这个过程2.卵子的采集与成熟培养超数排卵是指在母畜发情周期的适当时间用人工的方法促使其有更多的卵发育、成熟、排卵的一项技术。目的-----人工地使动物的激素水平达到阈值，从而诱发卵的成熟与排放。方法-----主要是向动物体内注射某些促性腺激素，对卵巢产生作用促进排卵。这些激素包括：孕酮、雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）、促性腺激素释放激素（GnRH），前列腺素，孕马血清促性腺激素等。影响超数排卵效果的因素：供体年龄、供体品种差异、激素的处理剂量、卵巢状况等。成熟卵细胞收集方法：成熟卵细胞的收集----腹腔镜、吸管关键掌握卵细胞进入输卵管和卵细胞在输卵管中维持受精能力的时间。卵巢上有腔卵泡卵母细胞（1）活体卵巢采集----超声波探测仪、腹腔镜、吸卵针（2）从屠宰的家畜卵巢中采集。可以立即取下卵巢，保存在37度的无菌生理盐水中。应在1－4h内收集卵泡。时间越长，卵子质量越差。在无菌条件下用PBS溶液冲洗卵巢。卵母细胞的选择----卵丘卵母细胞复合体要求：形态规则、细胞质均匀、外围有多层卵丘细胞包围卵母细胞体外成熟培养：通常用于动物细胞培养的培养液均可作为卵母细胞体外培养的培养液，TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成分。培养方法：微滴培养法注意：外界温度、渗透压、pＨ、气相卵母细胞成熟标志（第二次减数分裂中期）1.生发泡破裂2.染色体凝集3.纺锤体形成4.极体排出5.透明带软化6.卵丘细胞扩展体外受精（1）对于试管动物的培育而言，一般将成熟的卵母细胞和获能的精子在一个合适的体外环境条件下共同培养一段时间，就能完成体外受精。（2）对于动物养殖场的胚胎移植过程中的体外受精，不需要从供体获得精子和卵子，而是直接将精子输入经过超排卵处理并观察到处于发情期的母体内，在体内发育成受精卵。体外受精共培养肾上腺素、亚牛黄酸、肝素－－有助于精子穿卵和促使原核的形成16~20h后，卵细胞周围颗粒细胞去除----注射器、微吸管受精成功的标志是卵细胞内出现两个雌雄原核。受精成功的评价看受精卵是否可以发育至囊胚期阶段。体外人工受精提高人工受精的方法：显微受精技术，是体外受精与显微操作技术相结合的一项胚胎工程技术，使由透明带和卵质膜所形成的生理受精障碍得以排除。透明带下注射法：用微注射器将3-5个精子直接注射入透明带下的卵间隙,从而使卵子受精.卵浆内精子注射法:用微注射器将单个精子直接注入到卵细胞质内使卵子受精.透明带修饰法:是用人工的方法破坏卵子的透明带，使精子比较容易地通过破损处进入卵子并受精．（破坏的方法：机械法、化学溶解法、激光法）目前制约体外受精的主要因素是:①在体外培养的卵母细胞,其细胞是否真正成熟,细胞质是否真正成熟不仅影响到受精,而且对卵裂及胚胎发育甚至着床和出生后也有较大影响,应在培养条件上进行研究。②多精子受精难以控制,导致正常发育率低;可通过调整精子浓度或受精时间来控制。③体外受精的胚胎在体外发育至一定阶段时发生发育阻断(block),不同动物其阻断的阶段亦不同;运用共培养或在培养液中添控制特殊成分可使一部分胚胎通过发育阻断阶段继续发育。季节性繁殖动物,在非繁殖季节内,其卵母细胞体外成熟比较困难。受精卵的发育与体外培养发育阻滞：体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为发育阻滞。原因：自身----母源信息调控向自身基因调控的转换环境----H2O2不能及时清除，不断积累，造成细胞中毒影响因素分析：能量底物－－低剂量葡萄糖添加氨基酸－－必需氨基酸、非必需氨基酸、谷氨酰胺血清—最初发育有损害作用，24-48h后添加细胞因子----EGF促进胚胎发育，增加蛋白质合成和囊胚的孵化抗氧化作用----还原型谷胱甘肽、维生素C、牛磺酸、低氧体细胞共培养----饲养层细胞产生胚胎营养因子，对抗胚胎毒性物质胚胎移植－－选择与供体发情周期同步的、生殖道正常、无疾病、繁育史良好的受体接受胚胎移植.手术法—仰面固定，麻醉，排卵和黄体发育情况，腹部切口，将子宫远端拉出，胚胎输入。非手术法－－使用专用的输胚枪，将其直接插入排卵侧子宫角，注入胚胎．试管婴儿2008年7月中旬时，露易丝布朗在爱德华兹等陪同下提前庆祝30岁生日。试管婴儿试管婴儿发展的三个阶段第一代试管婴儿：共培养第二代试管婴儿：卵细胞浆内单精子显微注射；其受精不受精子浓度和形态的影响，并且正常受精率高、多精受精率低。技术关键：显微操作系统的建立、显微注射技术的建立等。第三代试管婴儿：种植前遗传学诊断（PGD）是指从体外受精的胚胎取部分细胞进行基因诊断，排除带致病基因的胚胎后才移植，使人们实现胚胎着床前即诊断出遣传病的愿望.预防遗传病、提高出生人口素质等，将有广阔的前景。女性生殖器技术步骤女方超排卵治疗阴道超声引导取卵----超声装置和穿刺针结合的引导探头取卵丈夫精液体外优化处理体外受精受精卵培养胚胎移植子宫内发育、出生存在问题----提高胚胎移植成功率1.控制性超排卵与取卵a.CC,hMG-----激发卵泡生长hCG-----激发卵母细胞继续进行减数分裂b.超声装置和穿刺针结合的引导探头取卵：将阴道探头放入阴道，探头超声扫描，当探测到卵泡后，穿刺针刺入卵泡，负压吸取2~3ml卵泡液c.成熟培养---微滴培养室温20℃，液化20~30min清洗精子，去掉精浆培养液50min2.精子采集与获能处理3.体外受精（invitrofertilization,IVF)a.共培养b.显微注射法提高人工受精的方法：透明带下注射法卵浆内精子注射法透明带修饰法4.受精卵培养5.胚胎移植a.阴道超声波引导下插入导管与宫腔中，注入胚胎移植液b.卧床，注射孕激素c.早期妊娠检查与诊断6.胚胎移植后处理与观察a.补充黄体酮，确定是否妊娠b.补充hCG至怀孕十周c.B超检验胎儿数及胚胎着床部位存在问题体外受精成功率90%；卵裂率70%；胚胎移植后的妊娠率只有25%-30%；胎儿分娩成活率仅为10%-15%6.3人工授精定义：将采集的精子注入发情处理的母体内完成受精过程。发展：1780年意大利的科学家司拜伦瑾尼(Spallanzani)首次以狗为实验动物开展人工授精试验获得成功,随后进行一系列的类似试验.1899年,俄国科学家伊凡诺夫将人工授精作为一项畜牧技术在马和牛上较大规模地被应用。人工授精繁殖动物意义：提高优秀种公畜的利用率加速品种改良家畜配种不受时间及地域限制大幅度减少种公畜的饲养数量克服公、母畜体型悬殊和种间交配困难防止疾病传播有利于提高母畜的受胎率一、人工授精技术采精---假阴道法、按摩法、手握法、点刺激法精液处理---精液稀释输精---输精器一般情况下，经过超排卵处理的母体动物在停药后24－48h内有95％的母畜表现发情，在观察到发情的当日上午和下午或夜晚和次日晨进行人工受精两次，两次输精可以保证已排除的卵受精。因为通过超排卵处理后有大量卵子排出，因此需要加大输精量。可用原精0.2ml（约含4亿精子）／次。二、胚胎回收离体生殖道回收法回收输卵管早期胚胎回收进入子宫的小鼠胚胎外科手术回收法－－打开腹腔，找到子宫角，将冲卵管导入子宫角内，慢慢注入冲卵液，并回收。冲卵液用量少、容易检卵、回收率高适用于中小型动物非手术回收法非手术回收法－－借助采卵器从阴道到达子宫采集胚胎适用大型家畜、母畜受伤害小、可重复多次取卵、方便简单胚胎鉴别分级一级，胚胎发育完好，胚胎形态完整，轮廓清晰，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无附着的细胞和液泡。二级，胚胎发育尚好三级，胚胎发育一般，但可用四级，胚胎发育停止或已退化，轮廓不清晰，色调发暗，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性的细胞达30—50%。凡在发情后第六到八天回收的16细胞以下的受精卵均应列为非正常发育胚胎，不能用于移植或冻存。3、胚胎分割定义：借助显微操作仪切割早期胚胎成多等份，再移植给受体，从而制造同卵多仔后代的技术，是一种广义上的动物克隆技术。意义（1）胚胎分割技术以增加优秀遗传特性的动物数量为主要目的。（2）控制动物性别的目的。在进行胚胎切割时为了便于操作和切割后的胚胎发育，一般选用发育到桑椹胚或囊胚最为适宜。一般借助微针或微刀对准胚胎内细胞团的部分进行均等的直接下切，以保证切割后的部分有均等的发育能力。从理论上讲胚胎的切割可能是无限的，但是实践证明只有二分胚的发育能力最强。分割方法：机械分割法酶解－机械分割法胚胎冷冻保存技术短期临时保