答案评分--2009-2010年体内药物分析期末试卷

中国药科大学体内药物分析期末试卷（硕士）2009-2010学年第一学期院系专业学号姓名题号一二三四五总分得分核分人：一、填空题（每空0.5分，共20分）1.沉淀血浆蛋白的常用沉淀剂为甲醇、乙腈、乙醇。2.在定量体内药物分析中，衍生化技术的主要目的是提高检测灵敏度。药物分子中含有活泼氢者都可被化学衍生化。其中，GC法中的衍生化反应有烷基化、酰化、硅烷化、生成非对映异构体的衍生化法。3.毛细管电泳免疫分析是将毛细管电泳的高效能分离能力和检测能力，同免疫分析具有的特异选择性结合的一门分析技术（1分），分为竞争性CEIA和非竞争性CEIA两种模式。4.血样采集时，受试者每次采血量为1-5ml，动物实验中采血量不宜超过总血量的1/10。5．药时曲线常出现双峰或多峰，是由于肝肠循环和药物释放时间长在大肠吸收。6.当前测定游离药物浓度的主要手段与技术有平衡透析法、超滤法等。7.在生物机体内，药物的Ⅰ相代谢一般是为Ⅱ相代谢作准备，通常在药物母体结构中产生－OH、－NH2、－SH、－COOH等官能团，以便进一步发生Ⅱ相代谢反应。8.药物在体内的主要代谢部位是肝脏，药物代谢产物研究中，体外代谢生物转化常用的方法有肝微粒体温孵法、肝灌流法、肝细胞体外温孵法、肝切片法；其中获得的代谢产物与体内产物最接近的是肝切片法。温孵体系实验条件的优化分为药物（探针底物）、辅因子再生系统、微粒体三方面。9.选择内标物基本原则：结构相似，色谱保留与待测物近似，离子化效果与待测物一致，不能是内源性物质，不能是食物中所含的物质（写出其中3条以上即可）（1分）。以MSD作为检测手段时，最理想的内标物是用同位素标记的待测物。10．LC-MS的离子检测方式有如下两种：SIM检测方式主要在含量测定时用，定性检测时用SCAN检测方式。11.SPE小柱，按填料的类型可分为亲脂型、亲水型、离子交换型，其中，检测三聚氰胺应选用离子交换型的SPE小柱。12.两种或两种以上药物在同时或前后序贯用药时，导致药物代谢性相互作用中最常见的原因是CYP450酶的诱导和抑制；二、问答题（共80分）1、图1为药物DDPH的Ⅰ相代谢物M3的化学结构，已知M7为M3在体内转化而得的DDPH的Ⅱ相代谢物，图2和图3分别为采用LC-MS技术获得的M7和M3在170VCID条件下的MS图谱，请根据图2和图3推测M7的结构。（2分）图2DDPH的Ⅰ相代谢物M3的结构图3M7在170VCID电压条件下获得的ESI-MS图图6DDPH的Ⅰ相代谢物M3在170VCID电压条件下获得的ESI-MS图答：M7为M3的葡萄糖醛酸结合物OCH2CHNHCH2CH2CH3OCH3OCH3CH3CH3OOOHHOHOHOOC2、体内药物分析中常见不稳定样品有哪些类型，应当如何处理？（5分）答：（1）易发生水解反应的药物。处理：蛋白质变性、酶抑制。（2分）（2）易发生氧化反应的药物。处理：加入抗氧剂、衍生化。（2分）（3）其他：光敏感药物需避光；易水解药物选择适当溶剂，调节pH；对所有不稳定药物都应尽快处理。（1分）3、何为介质效应、carry-over效应，请简要说明用LC/MS测定生物样品中药物的含量时如何对这两种效应进行考察。解决这两种效应的方法有哪些？（10分）答：（1）介质效应：由于样品中存在的干扰物质，对响应造成的直接或间接地影响。Carry-over效应：残留效应。（各1分）（2）介质效应考察：本法需配制2组不同的标准曲线，每组包括5条。第1组用流动相配制，制成含系列浓度待测组分的标准曲线。第2组标准曲线是将5种不同来源的空白生物样品(如：血浆)经提取后分别加入与第1组相同系列浓度的待测组分后制得。通过比较两组标准曲线的斜率，可以确定基质效应对定量的影响。其考察参数值在85%到115%之间可以忽略介质效应。（2分）Carry-over效应考察：进样高浓度之后，进样空白样品或溶样流动相，观察样品峰峰位处有无信号，无信号则无残留；有残留，若响应小于等于LLOQ的10%，则忽略；若大于LLOQ的10%，认为有残留。（2分）（3）介质效应消除方法：优化改进进样提取制备方法，优化色谱条件，选择适当接口，选择适当内标。（2分）Carry-over消除方法：更换洗针液，考察进几针空白样品或溶样流动相后残留可忽略，重新选择离子。（2分）4、以下是沙丁胺醇的结构式，已知采自健康收试者的一批血浆样品中沙丁胺醇的浓度在0.1ng/ml-20ng/ml的范围内，回答下列问题：（1）设计四种可测定沙丁胺醇血药浓度的检测技术，并阐述理由（8分）；（2）设计测定方法的标准曲线和质控样品的浓度，并阐述理由（4分）；（3）请给出方法学评价的各项内容的名称，评价方法及其可接受的范围（12分）。HOHOHNOHC(CH3)3沙丁胺醇的结构式答：（1）血药浓度低，故选择的方法要有有较好的灵敏度，响应大。（各2分）HPLC-电化学检测器：电化学检测器只对酚-OH有响应，选择性好响应大；三氟乙酰化GC-ECD：引入三氟甲烷,ECD响应值高,沙丁胺醇本身有一定挥发性；硅烷化GC-MS：结构中含N，MS灵敏度较高，硅烷化进一步提高挥发性；LC-MS：结构中含N，MS的灵敏度较高。（2）BQ:0.1,0.2,0.5,1,2,5,10,20ng/ml,QC：0.2,6,18ng/mlBQ:先等比，后等差；不少于6个点;QC:低浓度为最低浓度的2、3倍，中浓度包含70%左右浓度，高浓度为最高浓度的85-90%（每点1分）（3）特异性：考察来自6个不同个体的空白生物基质，必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质或其他代谢物及替他药物不得干扰对样品的测定。标准曲线和定量范围：配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，至少用6个浓度建立标准曲线。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。定量下限：标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LLOQ应能满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1／10～1／20时的药物浓度。其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，相对标准差(RSD)应小于20%。精密度与准确度：一般要求选择高、中、低3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在LLOQ的3倍以内，高浓度接近于标准曲线的上限，中间选一个浓度。批内精密度，每一浓度至少制备并测定5个样品。批间精密度应至少在不同天连续制备并测定3个合格的分析批，至少45个样品。通常用质控样品的批内和批间RSD来考察方法的精密度。一般RSD应小于15％，在LLOQ附近RSD应小于20％。准确度一般应85％～115％范围内，在LLOQ附近应在80％～120％范围内。样品稳定性：根据具体情况，对含药生物样品在室温（1~10h）、反复冻融（至少三次，每次时间至少24h,12h,12h）或长期冰冻条件下进行稳定性考察。还应考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性。提取回收率：应考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应当精密和可重现。质控样品：高、中、低3种浓度，双质控，每个分析批至少插5％质控样品（但至少6个质控样品）。质控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度点偏差一般应小于20%，最多允许1/3的质控样品结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度中。5、试简述常见的生物种类及其制备、贮存的方法。（10分）答：（1）血液。血清样品：室温下放置至少30min到1h，待凝结出血饼后，用细竹捧或玻璃棒轻轻地剥去血饼，以2500～3000rpm离心5min使与血细胞分离，分取上清液即得；血浆样品：置含有抗凝剂的试管中，混合，以2500～3000rpm离心5min使与血细胞分离，分取上清液即得；全血样品：置含有抗凝剂的试管中混合，不离心。（3分）（2）尿液：测定一定时间内（如8h、12h或24h等）尿液中药物的总量将排泄的尿液全部储在起来，并记录其体积，取其一部分测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。尿液采集后需立即测定或加入适当的防腐剂保存。（1分）（3）唾液：测量体积，静置分层后离心（3000rpm,5min)，取上清。放置后分为泡沫部分、透明部分、灰乳白色沉淀部分。（1分）（4）组织：先将组织均匀化，脏器组织用生理盐水清洗后，滤纸吸干表面水分，称重，加入一定量的水或生理盐水等，在匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，之后可直接可取上清液，或用加入蛋白沉淀剂，加入一定量酸或碱，酶解法等方法萃取。（2分）（5）毛发：清洗，反复清洗2～3次，再有机破坏，最后提取（甲醇、酸碱液、酶解）。（1分）贮存：1.冰冻（短期保存：可置4℃冰箱中冷藏；长期保存：需置-20℃或更低温度冰柜中冷冻；临时来不及处理：先置冰屑或冰块中，然后再进行冷冻贮存；小体积分装贮存）2.去活性：加防腐剂，改变生物样品pH。（2分）6、简要说明直接沉淀法、液液萃取法、固相萃取法3种生物样品预处理技术的操作步骤、注意事项，并比较三者。（12分）答：（1）直接沉淀法：将一定量生物样品加蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清夜进样。注意沉淀剂体积、沉淀剂的选择及对药物稳定性的影响（氧化、对酸不稳定）。（2分）液液萃取法：取一定量生物样品加有机提取溶剂，涡旋，离心，取有机层，氮气吹干，流动相溶样进样。注意⑴水相pH值，⑵提取溶剂选择，⑶有机相和水相的体积。（2分）固相萃取法：将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到“吸附”或“分配”或“离子交换”或其它亲和力作用时，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂洗除杂质，再用适当溶剂洗脱药物。注意⑴流速，⑵装样量，⑶缓冲液pH及用量。（2分）（2）比较：直接沉淀法：待测物浓度较高，特异性和灵敏度达到检测要求时可用。直接沉淀法可使结合型的药物释放出来，操作简单，但缺点在于容易发生乳化现象。液液萃取法：有选择性，基于其提取溶剂的性质，能与多数内源性物质分离，缺点在于乳化现象的产生；有机溶剂易挥散、有毒性、对环保不利及不能自动化也是该法的不足之处。固相萃取法：萃取剂与样品有很大的接触面，短时间内可有效的萃取，可自动化；可以避免乳化的形成；柱子可弃，无污染。缺点在于价格昂贵，技术要求高，批与批之间有差异，柱子易阻塞，影响分离效果。（各2分）7、使用LC-MS进行体内药物分析，试简述色谱条件选择的注意事项。（9分）答：色谱条件选择：（1）流动相：优先使用低水比例；提高有机相比例可提高离子化水平，一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈；选择挥发性缓冲盐；适当PH。(3分)（2）流动相的流速和色谱柱的选择：流速受柱子内径、流动相组成影响，较小流速可获得较好的离子化效果，尽量选内径小的色谱柱（2.1mm，0.2—0.4ml/min）；ESI柱后分流不影响信号。（3分）（3）柱后补偿技术：LC、MS要求条件冲突时使用，调整pH值，达到尽量高的离子化效率；加入异丙醇可加速含水多流动相的脱溶剂过程；对无或弱离子化能力分子，柱后加乙酸钠（50mol/L），使高效率产生［M+Na］+离子；利用柱后三通分流，降低流动相流量；柱后衍生化；应用“TFA-fix”技术解决三氟乙酸（TFA）对蛋白质信号的压抑作用。（3分）8、请比较LC-MS仪中的ESI、APCI的工作原理和适用范围，下列药物分别适合采用哪一种离子化方式（并注明是正/副离子模式）。（8分）OOHNHCH3CH3OCH3OooOHOOCOOHHOOHOHOHCOOHH3CCH3HH3CHCH3CH3HCH3COOHH3C美托洛尔甘草甜素CH3CH3CH3CH3CH3OH3C替普利酮雌炔醇答：（1）ESI原理：样品溶液通过具有高静电梯度（约3kV/cm）的喷雾毛细管时，发生静电喷雾，并在干燥气中形成带电雾滴，随着溶剂的蒸发，生成气态离子，气态离子沿着电压