糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展

糖组学中糖蛋白糖链的研究技术及进展1988年牛津大学Dwek教授在AnnualReviewofBiochemistry上发表了题为“Glycobiology”(糖生物学)的综述，首次提出了糖生物学这一概念，标志着糖生物学这门学科的诞生[1]。在十几年后，糖生物学在糖链结构、生物合成、生理功能等方面取得了极大地进展。作为第3种生命信息分子的糖链正越来越受到重视，于是糖组学被誉为是继基因组学和蛋白质组学后的第三领域。糖组是指细胞内所有的糖链，包括糖复合物[2]。糖组学是研究糖链的表达、调控和生理功能的科学，通过研究糖链确定基因所携带的遗传信息与功能之间的关系。糖组学的研究依赖于糖组研究技术的发展，其中糖蛋白和糖链的研究技术比较成熟，本文主要对这两方面进行综述。1.糖组学研究的内容及意义基因对生命活动的调控是由基因所编码的蛋白质及其所合成的糖链和脂类来体现的，因此基因功能的阐明不仅需要基因组学的研究，还必须开展蛋白质组学和糖组学的研究。糖链、核酸和蛋白质都是生物大分子，但是糖链的结构远比核酸和蛋白质复杂，这是由于聚糖的糖单位之间糖苷键的链接方式的多样性[3]。糖链参与几乎所有真核生物的每一生命过程，其功能是复杂而多样的在分子内，糖蛋白糖链影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等。在分子间，糖链可以通过糖基化影响蛋白的功能，更重要的是还与信号传递、细胞通讯密切相关。.糖与糖之间的相互作用介导细胞-细胞相互作用也被证实.因此糖组学的重要研究内容之一就是作为信息分子的糖类如何在细胞识别和信号传导中发挥作用[4]。为了研究糖类在细胞识别和信号传导中的作用首先要完成4个方面：什么是基因编码糖蛋白，即基因信息；实现被糖基化的位点，即糖基化信息；聚糖结构，即结构信息；糖基化功能，即功能信息[5]。目前预测细胞内超过５０％的蛋白质为糖蛋白，在这些糖蛋白中蛋白质是生理功能的主要承担者，而糖链则通过改变蛋白质的折叠方式、生物活性、溶解度、疏水性、聚合、降解、电荷、粘度及质量，对蛋白质的功能起修饰作用。也即意味着糖可通过影响蛋白质的整体构象，从而影响由构象决定的所有蛋白质功白中分离纯化糖肽。糖组学研究的策略主要包括3项内容：（1）收集单一个体中的全部聚糖亦即糖组；（2）锁定要研究的糖肽,并将糖组中的各种糖肽组分与基因组数据库相联系,最大限度地利用基因组的已有成果。否则，如果将聚糖与糖蛋白脱离，也就无法获得基因组信息；（3）研究包括cosmidID、分子量和凝集素解离常数在内的特定糖肽的特征性质.最后一点将是糖组学研究的主要内容[6]。2.糖蛋白的结构与类型蛋白中蛋白质肽链可在不同部位结合多个糖基或聚糖，含糖量一般为2%～50%。糖基或糖链与蛋白质肽链的链接方式主要为O-连接和N-连接两种。参与糖肽键的氨基酸残基主要有：天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、羟赖氨酸(Hyl)和羟脯氨酸(Hyp)。它们可以与N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、木糖、半乳糖及阿拉伯糖形成5种主要的糖肽键,分别是:β-N-乙酰葡萄糖胺-天冬酰胺（GlcNAc-Asn)、α-N-乙酰半乳糖胺-丝氨酸/苏氨酸(GalNAc-Ser/Thr)、β-木糖-丝氨酸(Xyl-Ser)、β-半乳糖-羟赖氨酸(Gal-Hyl)、α-L-阿拉伯糖-羟脯氨酸(Ara-Hyp)。此外,还发现罕见的以N-末端氨基酸残基为连接点的糖肽键,存在于小鼠血红蛋白A1c中[7]。3.糖蛋白的提取和分离纯化糖蛋白往往存在于活体组织或者体外培养的细胞表面，属于膜蛋白，水溶性不好，其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之一。目前常采用先制备质膜,然后用去污剂释放或TritonX-114相分离、有机溶剂萃取等方法提取糖蛋白。糖蛋白的分离制备常采用离子交换层析、凝胶过滤、凝集素亲和层析等方法获得，其中由几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素亲合层析(SLAC)法是较好的方法[8]。在糖组学糖蛋白糖链结构研究中,随着研究技术的发展,也有不经过糖蛋白提取纯化的步骤而以整个细胞为研究对象,直接对其表面糖蛋白糖链进行相关结构研究的，比如糖芯片法技术。尽管这种方法较为便捷,但其所获得糖链结构信息比较有限。4.糖链的获得4.1糖捕捉法一些游离糖、单糖和寡糖可与植物凝集素特异结合，通过不同凝集素柱可直接富集得到目标糖链。通过与糖组学组数据库结合使用,这种方法能系统地鉴定可能的糖蛋白和糖基化位点,目前大量用于糖组研究。常用的凝集素有刀豆素A（CoA）、半乳糖凝集素（LEC-6或GaL6）、花生凝集素（PNA）、橙黄网胞盘菌凝集素（AAL）等，但是值得注意的是不同类型的糖蛋白和糖肽需要使用不同的凝集素。具体过程如下[9]：（1）凝集素亲和层析-1(用于糖蛋白分离)：凝集素柱的分离效果与要分离的糖蛋白的聚糖类型有关，因此不同组别糖蛋白的纯化步骤可以单独或串联使用不同的凝集素柱。（2）蛋白质消化:将分离得到的糖蛋白用相应的蛋白酶消化为糖肽。（3）凝集素亲和层析-2(用于糖肽分离):采用与步骤1相同的凝集素柱从消化液中捕集目的糖肽。（4）得到糖链：用N-寡聚糖糖肽酶消化糖肽释放出肽链和糖链。（5）肽链和糖链分别经HPLC/MS分离鉴定并获得肽序列和糖链分子量。（6）结合已有的数据库，分析蛋白质和糖的结构信息。（7)然后,使用不同的凝集素柱进行循环，捕集其它类型的糖肽，以对某种糖蛋白进行较全面的糖组学研究。4.2电泳法硫酸化、唾液酸化的蛋白糖链可用电泳法分离纯化。中性蛋白糖链通过与硼酸作用形成带电的复合物，也可用电泳分离。电泳技术不仅可以对糖蛋白糖链进行一定的分离纯化,还可以给出其相关结构信息。荧光辅助糖电泳(FACE)、毛细管电泳(CE)等是糖链分离纯化、结构解析的常用工具。糖链在荧光标记后进行的PAGE电泳即FACE,通过RAAM法和标准糖链的比对可以给出目标糖蛋白糖链的结构信息,相关的N-糖链FACE测序试剂盒已商品化。CE可快速分离分析微量糖链,且不同缓冲体系中标准糖链的CE行为构建的糖谱，可以用于相关未知糖链的结构鉴定。但CE重现性不好,目前还不能用于制备。SDS-PAGE胶上酶解法可同时分析糖蛋白糖链结构和糖基化位点，适用于不易纯化或量少的样品，是糖组学糖蛋白糖链结构研究的有力工具。此外二维电泳结合特殊染色技术获得糖链的方法灵敏度高，检测限度可达300pg。4.3液相色谱法多维液相色谱法是一种精确的糖组分离系统。Takahashi[10]等建立三维糖谱图技术是用N-寡聚糖糖肽酶消化糖肽释放糖链，用高碘酸衍生在HPLC上，先后经过二乙基氨基乙基离子交换柱、C18疏水柱和硅酰胺亲水柱分离，洗脱数据分别列在三维坐标上，获得三维液相糖图谱，借助连续的外切糖苷酶消化目标聚糖点获得结构信息。4.4固相萃取技术固相萃取是由色谱理论发展的一种固-液相萃取的物理过程。样品中目标成分通过溶剂流通被吸附在固相上，而其他杂质则随溶剂流出，再通过合适的洗脱剂将目标成分洗脱下来，获得所需目标成分。现常用石墨碳固相萃取小柱和C18小柱富集纯化糖链。C18小柱用键合硅胶C18做填料为反相吸附剂，石墨碳小柱填料即为活性炭，二者常用于分离糖链与蛋白质及除去盐等杂质[12]。4.5糖微阵列技术糖微阵列技术是生物芯片中的一种，是将带有氨基的各种聚糖共价连接在玻璃芯片上，芯片的表面可以进行化学反应。一块芯片上可排列200种以上不同的糖结构，几乎函盖了全部末端糖的主要类型。因为糖蛋白通常只能识别糖链中的最后几个末端糖残基，推测天然存在的末端序列大约有500种左右。这种技术已成功用于糖结合蛋白(凝集素)的筛选和表征[13]，但目前可用于微阵列的糖数量还非常有限,从而限制了该技术的广泛应用.为此,有研究等用凝集素代替聚糖固定在芯片上，建立了凝集素微阵列技术，以快速分析糖基化蛋白质[13]。随后,又将瞬息场荧光检测技术与凝集素微阵列相结合，形成瞬息场荧光辅助凝集素微阵列技术，即时观察多种糖-凝集素反应，显著提高了检测灵敏度。5.糖链的鉴定技术5.1质谱法质谱可以对各种糖链进行结构分析,是解决糖链结构的有效手段。用于糖组学的生物质谱目前主要有电喷雾电离质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS)［14,15］、傅立叶变换离子回旋共振质谱等。电喷雾质谱和基质辅助激光解吸飞行时间质谱因其独特的“软电离”方式，可较好地对高极性、难挥发、热不稳定的糖等生物大分子进行结构分析而被称为生物质谱。糖链结构研究中，ESI-MS无需衍生化就能确定糖链的组成和结构，但易受样品和溶剂中干扰物的影响。与之相比，MALDI-TOF-MS因对干扰物忍受力强、产生的碎片离子少和图谱没有ESI-MS中的多电荷特性而更容易解析等优点而成为目前糖链结构解析的常用工具。5.2核磁共振法目前，核磁共振（NMR）技术已成为糖链立体化学结构分析最重要的方法之一，可确定糖链的构型、连接位置、支和微观多样性。研究人员利用二维1HNMR技术糖蛋白的糖链进行结构分析。此后，利用ESI-MS和1HNMR技术发现了人乳中新的糖链结构。但NMR测定糖的讯峰重叠严重，解析较难，灵敏度不高，而且多维NMR需要毫克级样品，这对多数糖复合物中的微量糖链是很难达到的。6.展望糖组学已经是继基因组学，蛋白质组学之后给生命科学带来新鲜血液的部分，所以发展糖组学势在必行。糖组学的研究完全依赖于糖组学技术的发展，当然糖组学技术近年来已取得明显进展，有力地促进了糖组学的发展。但因糖链本身结构的复杂性，在技术上仍然面临许多问题需要解决，如糖链的结构分析和共价键的确定仍是低通量的工作，尚缺乏快速、大量测定细胞所有糖链结构的技术，在糖链的性质和功能研究尤其是功能研究方面进展缓慢。上述问题的解决尚需研究者艰苦卓绝的努力。参考文献[1]金城.中国糖工程研究的兴起与发展[J].生物工程学报,2015,31(6):797−804.[2]TaniguchiN,EkwuniA,koJH,etal.Aglycomicapproachtotheidentificationandcharacterlzationofglycoproteinfunctionfunctionincellstransfectedwithglycosyltransferasegenes[J].JournalofProteomics,2001,1(2):239-247.[3]王川.糖组学-破解生命信息的第3种途径[J].生物学通报,2005,40（5）:8-9.[4]金城.糖生物学-破解基因组功能的必由之路[J].中国科学院研究生院学报，2001,18(1):66-75.[5]杨珺,蔡绍皙,邹全明.糖组学研究技术及其进展[J].生物化学与生物物理进展，2005,32(1):9-12.[6]郭丽娜,王洪荣,李宪臻.糖组学研究策略及前沿技术研究策略[J].中国生物化学与分子生物学报，2006，22(9):685-690.[7]武金霞,赵晓瑜.糖蛋白的结构功能和分析方法[J].生物技术通报,2004（1）:31-34.[8]QiuR,RegnierFE.Useofmultidimensionallectinaffinitychromatographyindifferentialglycoproteomics[J].AnalyticalChemistry,2005,77(9):2802—2809.[9]LeeLY,HincapieM,PackerN,BakerMS,etal.Anoptimizedapproachforenrichmentofglycoproteinsfromcellculturelysatesusingnativemulti-lectinaffinitychromatography[J].JournalofSeparationScience,2012,35(18):2445-2452．[10]TakahashiN.Three-dimensionalmapingofN-linkedoligosaccharidesusin