维生素B12的微生物工程生产研究进展

维生素B12的微生物工程生产研究进展摘要：维生素B12是种人体必需的维生素，已经广泛地用于医疗及食品行业。自然界中高等生物均不能合成维生素B12，工业生产中主要依赖少数细菌或者古细菌等的微生物发酵方式获得。多年来，通过遗传学改造菌株的代谢通路在菌株实际生产过程中极大地提高了产量。本综述中，我们概述了维生素B12的生物合成及其代谢调控，并从包括合成生物学和代谢工程等多个策略角度全面了解维生素B12的微生物工程生产研究进展。关键词：维生素B12；微生物工程；发酵工程；前言维生素B12(VitaminB12)或称钴胺素（Cobalamin），是一类含金属钴离子的B族维生素家族[1]。分子结构是以钴离子为中心的咕啉环和5,6-二甲基苯并咪唑为碱基组成的胺素类化合物。维生素B12的发现始于对严重贫血患者的胃分泌物中检测研究，美国内科医生卡斯尔在正常人胃部检测出维生素B12，却无法在恶性贫血病患的胃分泌物中发现。维生素B12在机体内主要充当辅酶功能，主要参与碳上的氢原子与邻位碳上一个基团之间的交换或者分子间的甲基转移反应，参与人体必需的氨基酸甲硫氨酸的体内循环途径及四氢叶酸的再生等生命活动。当上述反应受阻，核酸合成发生障碍而导致细胞分裂异常，出现巨幼红细胞性贫血（megaloblasticanemia）[2]，即恶性贫血。当前工业界生产B12的途径主要是依赖微生物工程，而微生物的B12合成途径主要包括两类即从头合成及补救途径[3]。微生物从头生物合成维生素B12通过两种代谢途径：在细菌和古菌分别为好氧途径或厌氧途径。维生素B12也可以通过补救途径利用大肠杆菌进行合成。但这些菌株具有其自身缺点，例如发酵周期长，发酵复杂而且设备昂贵，培养基要求高以及缺乏优良的遗传体系。迄今为止，研究者对于维生素B12大多数都集中在传统策略上，例如随机诱变和发酵过程优化，而对代谢工程的研究却很有限。最近，工程师们将注意力转移到大肠杆菌上，作为生产维生素B12的平台。鉴于生产途径及其代谢调节的复杂性，研究者已对维生素B12生物合成进行了大量研究。一、维生素B12的生物合成途径微生物的B12合成途径总体分两类，即从头合成（DenovoPathway）及补救途径（SalvagePathway）。所谓从头合成，是指原核生物利用小分子从头合成维生素B12，包括有氧途径和厌氧途径。有氧途径的合成主要是在非硝基甲烷菌中完成，而厌氧途径则是在S.typhimurium,Bacillusmegaterium，和P.shermanii。微生物B12合成首先是合成四吡咯环。四吡咯合成途径的第一个前体是ALA。ALA由C4途径或C5途径合成。在C4途径中，来自甘氨酸和琥珀酰-CoA的酶ALA合酶催化ALA的形成。在C5途径中，ALA由谷氨酸通过三种酶促反应合成。两个ALA分子通过胆色素原合成酶缩合形成单吡咯胆色素原，然后聚合四个胆色素原分子环化形成尿卟啉原III。该反应由酶胆色素原脱氨酶和尿卟啉原III合成酶催化[4]。补救途径（SalvagePathway）是细菌和古生菌获得维生素B12的另外一种途径，从耗能角度而言非常有效。在革兰氏阴性菌中，外源的皮质酮通过ATP结合盒(ABC)运输系统运输到细胞中，BtuC、BtuD和BtuF分别是膜渗透酶、atp酶和质周结合蛋白组分。BtuB是一种依赖于tonb的转运体，位于外膜，将皮质酮运送到质周皮质酮结合蛋白BtuF。后者将皮质递送到位于内膜的BtuCD复合体。在通过细胞膜运输之后，Cobinamide被ACAT酶腺苷化，家族内主要包括是CobA,EutT和PduO[5]。二、合成生物学角度提高维生素B12产量除了对微生物宿主进行遗传改造或鉴定全新的微生物宿主，构建基于合成生物学角度而易于遗传操作的异源生物也是合成维生素B12是非常有前途的策略。在异源宿主中构建维生素B12生物合成途径包括选择合适的宿主、构建合成途径以及途径调节。在选择理想寄主时应注意以下几点。(1)宿主应有能力提供前体(例如ALA)和辅助因子(例如S-腺苷蛋氨酸)用于生产所需的化学物质[6]。(2)需要足够的基因工程工具，例如表达载体，合适的基因片段[7]。(3)适合于工业规模的发酵，例如利用廉价且容易获得的碳源，像葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。合适的宿主可以用来表达来源不同的维生素B12。为了评估维生素B12生产的能力，工程菌株需要在最佳条件下培养。如何进行异源生物合成途径的设计，需要注意考虑几点。(1)考虑到宿主细胞具有前体和辅因子的供应能力、是否具有构建基因工程菌的内在工具以及是否具有能够使用廉价和容易获得的碳源从而具备工业规模发酵能力。（2）在体外和在体内验证酶活性。通过光谱分析、质谱或微生物分析检测体外或细胞内反应的产物。(3)通过基因组装方法对外源DNA片段进行组装，如SLIC、CPEC、Gibson、golden.、DNA组装器和LCR等[8]。为了减少建立代谢途径的难度，将其分为单独的模块，这些模块在异源宿主中按照顺序进行验证，然后组装。（4）基于代谢产物的限量，应消除瓶颈效应，使代谢通量达到目标化合物的最大化。为了优化代谢途径中的基因表达，可以在转录水平或翻译水平上进行设计，从提高启动子、RBS的基因拷贝数。（5）通过发酵实验验证工程菌的特性。从而优化各种底物(例如，ALA、钴离子、甜菜碱和DMB)和不同的发酵条件(例如，溶解氧浓度、pH和温度)以提高产率和生产率。三、维生素B12的代谢工程当种微生物具有自己的或异源的钴胺合成途径时，首要任务应致力于构建代谢网络，以提高维生素B12的生产和产量[9]。代谢工程允许微生物在整个有机体水平上被工程化，从而生产出远超出其天然能力的有价值的化学物质[10]。基于硅模拟的代谢设计和工程菌代谢状态的实验验证促进了系统代谢工程。许多基因组代谢通量分析是基于实验数据确定通量分布，并已用于精确估计限氧条件下反硝化细菌对不同比耗氧速率的中心碳代谢通量估算[11]。代谢通量分析表明，葡萄糖主要由Entner-Doudoroff和戊糖磷酸途径分解代谢。较高的比氧摄取率加速了前体、甲基和NADPH的供应，从而提高了维生素B12的产量[12]。四、增加维生素B12产量的其他策略除上述方法外，还可以通过其他的代谢途径提高维生素B12产量。例如，随机诱变法，随机诱变可产生具有高维生素B12产量的菌株[13]。具体方法可以通过紫外光或化学诱变剂都可以用来处理相应的微生物，然后可以选择具有所需表型的菌株，从而提高生产力、遗传稳定性或对高浓度有毒中间体的具有抗性。第二，可以基于高通量筛选的方法，此方法已经用于从大型文库获得所需的突变体。通过基因重组，将随机诱变和原生质体融合技术相结合从而提高雪氏疟原虫维生素B12产量。96h后，工程菌株比亲本菌株多产生约61%的维生素B12[14]。第三种方法MAGE法。与随机突变的基因组相比，MAGE提供了一种同时修饰多个基因组位置的有效方法。MAGE是基于λ红色重组系统。在大肠杆菌基因组中重复引入靶向多个位点的SSDNA导致各种突变体。结合标准的高通量筛选方法，MAGE可成为一种快速和有效的工具，以获得“理想”细菌生产者。第四种方法可称为“可跟踪多重重组（TRMR）”，这种方法可快速同步修改成千上万个基因。例如可通过改变启动子、翻译位点、开关、振荡器或传感器的功能区域，进行广泛的研究。为了更准确地测量维生素B12的合成量，生物传感器已被广泛应用于高通量分析中。可通过荧光测量不易检测的化学物质，生物传感器间接地反映化学浓度。维生素B12传感器已用于辅酶研究B12的合成。其优点具有较高的灵敏度，荧光或发光报告可显示细胞内维生素B12浓度。发酵工艺的优化可在培养基中添加维生素B12生物合成途径的前体，如钴离子、ALA、DMB、甘氨酸、苏氨酸或相容的溶质，如甜菜碱和胆碱。丙酸是弗氏平菇维生素B12培养过程的副产物，可引起微生物细胞生长的反馈抑制。可以通过膨胀床吸附生物反应器来控制丙酸的生成和DMB的添加，从而提高了维生素B12的生物合成。丙酸杆菌和富营养拉尔斯通菌的混合培养也可以解决这个问题，后者可以吸收前者产生的丙酸。为了降低培养基和发酵成本，可以使用廉价的碳源，如麦芽糖浆和玉米浆代替精制蔗糖[15]。结语维生素B12广泛应用于医药和食品工业，微生物通过复杂的途径产生维生素B12。为了维持稳定的维生素B12浓度，其生物合成和转运通过核糖开关在转录或翻译水平上受到调节。维生素B12是通过微生物发酵生产的，使用P.denitrificans和P.shermanii等菌株。由于可用于这些菌株的遗传工具相对较少，且发酵过程复杂，因此菌株工程一直关注于随机诱变和发酵过程的优化等传统策略。其中必须引入新的工程工具，如系统代谢工程，来操纵这些菌株。除了维生素B12的天然生产者外，E.coli还被用作异源宿主。为了给维生素B12生产的微生物细胞工厂的建设提供指导。我们总结了合成生物学和代谢工程策略，以及其他已经或可以应用于维生素B12生产的传统策略。这些策略已广泛应用于微生物菌种工程，以改善许多其他化学品的生产。在明确了解微生物中维生素B12代谢的基础上，利用这些策略应该促进微生物维生素B12产量的提高。参考文献1.RomainM.TheroleofVitaminB12inthecriticallyill--areview.AnaesthIntensiveCare.2016:Jul;44(4):447-52.2.YadavMK,ManoliNM,MadhunapantulaSV.ComparativeAssessmentofVitamin-B12,FolicAcidandHomocysteineLevelsinRelationtop53ExpressioninMegaloblasticAnemia.PLoSOne.2016Oct25;11(10)3.SwithersKS,PetrusAK,SecinaroMA,NesboCL,GogartenJP,NollKM,ButzinNC.VitaminB12synthesisandsalvagepathwayswereacquiredbyhorizontalgenetransfertotheThermotogales.GenomeBiolEvol.2012;4:730–9.4.CohenGN.BiosynthesisofcobalaminsincludingvitaminB12.InMicrobialbiochemistry.Dordrecht:Springer;2014.p.555–565.5.MooreTC,NewmisterSA,RaymentI,Escalante-SemerenaJC.Structuralinsightsintothemechanismoffour-coordinateCob(II)alaminformationintheactivesiteoftheSalmonellaentericaATP:Co(I)rrinoidadenosyl-transferaseenzyme:criticalroleofresiduesPhe91andTrp93.Biochemis-try.2012;51:9647–57.6.ZhangL,ChenJ,ChenN,SunJ,ZhengP,MaY.Cloningoftwo5-ami-nolevulinicacidsynthaseisozymesHemAandHemOfromRhodopseu-domonaspalustriswithfavorablecharacteristicsfor5-aminolevulinicacidproduction.BiotechnolLett.2013;35:763–8.7.LeeSY,KimHU,ParkJH,ParkJM,KimTY.Metabolicengineeringofmicroorganisms:generalstrategiesanddrugproduction.DrugD