红花油实验构思

红花油相关实验研究草稿（整理）导师让整理个方案朋友们给些意见哈实验思路1、黄酮含量的测定回归方程y=7.33x+0.055r=0.998分为冷、热、索氏提取x测定值冷1.2931.2681.1591.2400.0731.24热1.3471.2611.371.3280.0591.33索氏提取1.1411.2541.0741.1570.0911.162、多酚含量的测定3、甾醇含量的测定硫磷铁法测总甾醇含量采用硫磷铁法检测红花油中总甾醇含量2.5mol/LKOH乙醇溶液的配制将14.0g氢氧化钾溶解在10mL水中冷却至室温后用乙醇稀释至100mL标准胆固醇对照溶液的配制用乙醇配制成0,75,100,125,150,175mg/L等6个不同质量浓度的胆固醇溶液磷硫铁显色剂的配制精密称取2.5g三氯化铁溶于85%磷酸并用浓磷酸定容至100mL储存于棕色瓶中即为铁储存液冷藏可长期储存,取上述铁储存液1.5mL于棕色瓶中用浓硫酸定容至10mL室温下可储存6~8周.分别向上述6个标准胆固醇溶液加入磷硫铁显色剂2mL摇匀冷却至室温在480nm处测定吸光值得标准曲线取4mL甾醇样品B于试管加入磷硫铁显色剂2mL摇匀冷却至室温在480nm处测吸光值计算其中甾醇的含量试验进行3次重复.2GC-MS法(1).样品制备:称取0.1g的红花油油于试管中,加入1ml1M乙醇-氢氧化钠溶液,密封,摇晃20s,70°C下60min,每10min晃动一下,冷却至室温,然后加入1ml纯水,5ml正己烷,密封,大力摇晃3min,然后分离清液层(正己烷层),水层用5ml正己烷分离3次,收集正己烷溶液,加入1g的无水硫酸钠,旋蒸浓缩,得到样品.(2).GC-MS:180°C15°C/min280°C25min,样品入口温度为250°C，探测器温度为280°C.进样量1μl，氮气流量为1ml/min.离子源:EI源;电子能量:70ev;分子量扫描范围:40-550amu。红花油处理工艺毛油→预处理→脱胶→脱色→脱酸→脱色→脱臭→成品油沉淀物为粗磷脂油脚毛油→真空抽滤→预热80℃→加水/7％盐水→搅拌（保温）→（保温）离心→上清液即脱胶油可采用活性白土和活性炭进行脱色，脱色后的脱色油以正己烷作参比采用真空蒸汽脱臭法真空蒸汽脱臭法是在脱臭锅内用过热蒸汽（真空条件下）将油内呈味物质除去的工艺过程。脱胶：称取毛油200g置于500mL的烧杯中，将搅拌器的搅拌翅放进油中（搅拌器浸入油中2/3处）待油样升温至60~65℃，适当调快搅拌速度，用滴管缓慢加入油重0.1%磷酸和3%蒸馏水，搅拌25min脱胶，于3500r/min离心20min分离出脱胶油.将脱胶油转移到三口烧瓶中，放入磁力转子，在真空度0.09MPa105条件下脱水，直到油面上看不到水汽为止。抗氧化试验1红花油用7:3的氯仿和甲醇稀释至一定倍数，1%、5%、10%、15%、20%。2用蒸馏水配制7mmol/L的ABTS溶液和140mmol/L的过硫酸钾溶液,分别取20mLABTS溶液和352μL过硫酸钾溶液混合,在室温下暗处静置12~16h后,用无水乙醇将混合液稀释至OD734=0.700+_0.020时得到ABTS+自由基工作液,标准溶液的配制:用无水乙醇配制Trolox溶液浓度分别为20,40,60,80,100,120μmol/L.3取新制备的ABTS+工作液3mL，分别与不同浓度的油或Trolox样品1mL混匀，在室温下反应30min后，测定OD734，以不加油样的试样为空白，按下列公式计算样品对ABTS+自由基的清除率：ABTS+清除率=（1-A样品/A空白）*100以Trolox浓度为横坐标，不同浓度的Trolox对ABTS+的清除率为纵坐标，绘制标准曲线通过计算得到的瓜蒌籽油样品液的清除率，在标准曲线上找出其相对应的Trolox浓度，换算成Trolox当量浓度（mol/L），即TEAC（Troloxequivalentantioxidantcapacity）值羟基自由基清除率的测定测定方法采用Fenton反应，1mL0.75mmol/L的邻二氮菲溶液（无水乙醇配制），加2mL0.2mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.4），充分混匀后加入1mL0.75mmol/L的硫酸亚铁溶液（去离子水配制），每加一管立即混匀，加入1mL浓度为0.10.20.40.60.81.0mg/mL的样品溶液，最后加入1mL0.01%H2O2，于37℃保温1h，536nm处测定吸光度为A处理，将体系中的样品改为加入1mL蒸馏水，测定得A对照。空白对照不加0.01%H2O2，以蒸馏水补充体积，测定得A空白对照每个质量浓度样品做3个平行样品，取平均值羟基自由基的清除率计算公式如下：清除率（%）=（A536处理-A536对照）/（A536空白对照-A536对照）*100DPPH清除率的测定[12-13]称取一定量的，分别用无水乙醇配成浓度为5、10、20、40、60、80、100mg/mL，取2mL样品溶液，加入2mL0.2mmol/mL的DPPH溶液，摇匀，于25℃水浴中加热15min后，以无水乙醇调零，测定517nm处的吸光值Ai；取2mL无水乙醇代替样品溶液测得空白吸光度A0；以2mL样品溶液中加入2mL无水乙醇，测得样品本体吸光度Aj同一测定重复3次，取平均值按下式计算清除率：清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）/A0]*100Fe3+还原实验配制浓度为0．03mol/L的铁氰化钾溶液和pH为6．6的磷酸盐缓冲溶液样品组:1mL样品+1.25mL缓冲液+1.25mL铁氰化钾溶液，记为AS;对照组:1mL甲醇+1.25mL缓冲液+1.25mL铁氰化钾溶液，记为AC;阳性对照组:1mLTrolox+1．25mL缓冲液+1.25mL铁氰化钾溶液，同记为AS各组于50℃恒温反应30min，冷却后加入1．25mL10%的三氯乙酸溶液，在4000×g离心力下离心10min，取上清液1．25mL，并向其中依次加入1．25mL蒸馏水0．25mL0．1%的三氯化铁溶液，充分混匀，静置10min后，在700nm下测定吸光度(用蒸馏水调零)超氧阴离子清除活性：空白管：3mLTris-HCL+0.5mLTris-HCL+0.5mLNBT+0.5mLPMS对照管：3mLTris-HCL+0.5mLNADH+0.5mLNBT+0.5mLPMS样品管：3mL样品+0.5mLNADH+0.5mLNBT+0.5mLPMS以上样品依次加入各试剂，摇匀后放置5min，在560nm测定吸光度。其中Tris-HCL浓度16mM,pH=8.0，NADH浓度300µM，NBT浓度468µM，PMS浓度60µM。所有试剂及样品均用上述Tris-HCL溶解配制。清除率=1-A样品/A对照羟自由基清除活性空白管：1mL水+0.5mLEDTA-Fe+1mLPBS+1mL红花+1mL双氧水对照管：1mL水+0.5mLEDTA-Fe+1mLPBS+1mL红花花+1mLPBS样品管：1mL样品+0.5mLEDTA-Fe+1mLPBS+1mL红花+1mL双氧水加完后摇匀在37˚C水浴反应30min，520nm测定吸光度。其中PBS缓冲液（150mM,pH=7.4）红花(360µg/mL）,H2O2（3%）,EDTA-Fe(2mM)。EDTA-Fe和样品需要水溶，其余用PBS溶解。清除率=A样品/A对照还原能力：1mL样品加1mL铁氰化钾后在50˚C反应20min，再加2mL三氯乙酸，5min后加1.2mL三氯化铁。静置30min后700nm测定吸光度。直接以吸光度做曲线即为还原能力，吸光度越大，还原能力越大。溶剂为磷酸缓冲液（0.2M，PH=6.6），铁氰化钾（1%），三氯乙酸（10%），三氯化铁（0.1%）。除三氯化铁和样品以水配制外，其余加磷酸缓冲液配制。在2.5mLpH=6.6磷酸缓冲液中加入1mL待测液和1mL1%铁氰化钾溶液,混合均匀后将混合物在50℃恒温条件下加热20min后,急速冷却,加入2.5mL10%三氯乙酸,3000r/min离心分离10min。取上层清液5mL,依次加入5mL水和1mL0.1%氯化铁溶液,混合均匀,静置10min后在波长700nm下测定吸光值（A）。A值越大,则样品的还原力越强。DPPH清除能力：样品3mL加DPPH1mL后暗处放置20-30min后在517nm出测定吸光度。溶剂为40%甲醇溶液，DPPH以40%甲醇溶解为0.1mM溶液。对照为3mL甲醇+1mLDPPH。清除率=1-A样品/A对照接下来还有蛋白质含量测定种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。氨基酸含量测定亚麻酸亚油酸含量测定气相法甲基化重金属含量测定送检维生素含量测定送检与几茶籽油，大豆油，橄榄油，棉籽油的物质含量比较且比较不同方法提取的红花油以及抗氧化活性，遗传实验，急性慢性毒性实验，开发出功能食品