红花高效液相色谱指纹图谱研究.

实例一红花高效液相色谱指纹图谱研究红花为菊科红花的花，活血化瘀中药，有效成分为查耳酮类和黄酮类成分，其中羟基红花黄色素Ａ为主要有效成分之一。主产地新疆。红花药材指纹图谱研究主要针对查耳酮类和黄酮类成分，以新疆主产区药材为主要研究对象。1.实验材料样品红花采自新疆、内蒙古、陕西、河南、安徽等地，共31份样品，均经品种鉴定。对照品羟基红花黄色素Ａ，实验室自制。试剂乙腈（美国Tedia公司，色谱纯）、重蒸去离子水（实验室制备）、磷酸（分析纯）2.溶液制备供试品制备取样品粉末(过4号筛)2.0ｇ,精密称定,置具塞三角瓶中,加水50ｍL,称重,90℃水浴中提取1ｈ,称重,补足减失重量,滤过,精密量取续滤液10ｍL,微孔滤膜滤过,作供试品。参照物制备精密称取羟基红花黄色素Ａ对照品适量,加水制成0.2ｇ/L的溶液，作参照物。3.色谱条件与系统适用性试验Waters600型高效液相色谱仪,2996二极管阵列检测器,WatersMillenium色谱工作站；色谱柱为PhenomenexLuna(250mm4.6mmID,5µm)；乙腈-0.5%磷酸为流动相梯度洗脱，运行时间65min；柱温25℃；流速1.0mL/min；检测波长275nm。进样量：供试品及参照物各20µl。4.测试方法取待测溶液适量,注入液相色谱仪，按选定的测试条件，测定色谱图。并进行实验方法学考察。流动相选择经实验比较，乙腈-0.5%磷酸溶液梯度洗脱，能较好地使样品中各色谱峰分离且出峰最多；分析时间65min，样品1.5h图谱显示，65min后无特征峰出现。A：乙腈，B：0.5%磷酸溶液0—55minA（％）0—25B（％）100—7555—65minA（％）25—0B（％）75—100方法学考察稳定性试验：取同一批次供试品，在室温下放置，每隔一定时间进样后，测定，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度均大于0.95，表明供试品在测定的24h内保持稳定。精密度试验：取同一批次供试品，连续进样5次，考查进样精密度，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度均大于0.95，表明供试品进样精密度良好。重现性试验：取同一批次样品，按上法分别制备5份供试品，测定，用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算，结果相似度均大于0.95，表明本法测定的重现性良好。供试品测定同一上述实验条件下，测定10批次供试品HPLC色谱图。5.指纹图谱的分析与评价根据31批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参数，进行分析、比较，制定优化的指纹图谱。红花高效液相色谱可分离出约50多个色谱峰，经与参照物对照以及比较所有测定和记录的色谱图，选取其中36个共有峰作为指纹图谱的特征峰。共有指纹峰标定根据10批次供试品测定结果，标定共有指纹峰。红花HPLC指纹图谱中，共有指纹峰36个。与羟基红花黄色素Ａ参照物峰（22号峰）相比，其它35个共有指纹峰相对保留时间依次为：0.11、0.17、0.20……1.84、2.03。羟基红花黄色素Ａ共有指纹峰面积比除参照物峰以外，无共有指纹峰面积（峰）超过总峰面积的10%。相似度评价各地商品红花的指纹图谱,采用“计算机辅助相似度评价系统”软件进行数据处理,结果样品a～n的相似度分别为0.96,0.78,0.88，……0.93。新疆动新疆主产地,不同红花药材的指纹图谱相似度较高（均0.90)。尤其是吉木萨尔县红旗农场——红花栽培基地的红花指纹图谱相似度更高（多0.95)。指纹图谱中,保留时间在15～65min的12～36号色谱峰峰形及相对比例较稳定,体现了红花的共同特征；而保留时间在0～15min的1～11号色谱峰则变化较多,是不同药材的差异所在。商品红花指纹图谱的主要差异集中在4,5和6号峰的峰形及其相对高度上。新疆主产地红花指纹图谱,主要差异集中在2,3,4,5,6,8和9号峰的峰形及其相对高度上。实例二西青果高效液相色谱指纹图谱研究西青果为使君子科诃子或绒毛诃子的幼果。诃子含鞣质类、三萜类、酚酸类等成分。其中没食子酸、诃黎勒酸、诃子酸等鞣质为主要化学成分，含量高达23～37%。西青果传统来源主要从印度及斯里兰卡进口。1.实验材料样品共42个样品，均为各地市场商品（包括进口样品），绝大多数为进口药材收载的诃子TerminaliachebulaRetz.的幼果。对照品没食子酸、诃黎勒酸、诃子酸由中国药品生物制品检验所提供，供含量测定用。试剂醋酸乙酯、甲醇、丙酮、甲醇、磷酸、磷酸二氢钾（均为分析纯）,重蒸去离子水（实验室制备）。仪器Agilent1100液相色谱仪，DAD检测器。2.溶液制备供试品制备取样品粉末（3号筛）各0.05g，用丙酮热回流2次（50ml/30min），过滤，滤液蒸干，残渣用水做成10ml，冰箱放置约1h，取出，通过孔径0.45µm的微孔滤膜,滤液作为供试品。参照物制备取没食子酸、诃黎勒酸、诃子酸对照品,用30%甲醇分别做成50mg/ml的溶液,通过孔径0.45µm的微孔滤膜,滤液作为参照物。3.色谱条件色谱柱LiChrospher分析柱RP-18（4×125mm；5mm）；预柱：PhenomenexC18。流动相三元梯度洗脱：A.0.05M的磷酸液与0.05M的磷酸二氢钾液（1:1）；B.甲醇；C.醋酸乙酯。0~5minA（％）94~96B（％）6~3C（％）0~15~15minA（％）96~93B（％）3~2C（％）1~515~20minA（％）93~89B（％）2~6C（％）5~520~35minA（％）89~55B（％）6~40C（％）5~5流速1.0ml/min；柱温20℃；检测波长280nm；分析时间40min；进样量供试品及参照物各20µl。4.测定法取参照物及供试品溶液各20µl,注入液相色谱仪，按选定的测试条件，测定并记录色谱图。5.方法学考察(1)稳定性试验：取供试品溶液，室温下放置，分别在0、1h、2h、3h、4h、5h、24h、48h不同时间点进行检测，经计算机辅助相似度评价软件计算，结果相似度为0.9823～0.9993，表明样品在测定的48h内稳定。(2)精密度试验：取供试品溶液，连续进样5次，各色谱峰保留时间的相对标准偏差RSD均低于3%。（3）重现性试验：取同一批次样品，依法制得5份供试品液，平行测定，各色谱峰保留时间的RSD均低于3%。经相似度评价其相关系数大于0.9929，表明本法测定的重现性良好。6.指纹图谱建立根据10批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值（A）和峰位（tR）等相关参数，进行分析、比较，制定优化的指纹图谱。图3-42西青果HPLC指纹图谱123456789101112131415没食子酸tR=5.6′诃黎勒酸tR=29.3′诃子酸tR=33′7.西青果指纹图谱分析与评价西青果高效液相色谱可分离出约20多个色谱峰，经与参照物对照以及比较所有测定和记录的色谱图，选取其中15个共有峰作为指纹图谱的特征峰。共有指纹峰标定根据10批次供试品测定结果，标定共有指纹峰15个。与诃黎勒酸参照物峰（13号峰）相比，其它14个共有指纹峰相对保留时间依次为：0.080、0.131、0.189、0.237、0.344、0.475、0.595、0.674、0.760、0.779、0.808、0.947、1.028、1.122。图3-42西青果HPLC指纹图谱123456789101112131415没食子酸tR=5.6′诃黎勒酸tR=29.3′诃子酸tR=33′共有指纹峰特征整个色谱图分成3区段。第Ⅰ区(1～5号),主峰为1、3、5号峰，其表观丰度呈1号峰3号峰（没食子酸）5号峰；2号、4号峰为极弱峰，共同构成第Ⅰ区特征。第Ⅱ区(6～11号),共有特征是6、7、11号峰表观丰度呈递增趋势，丰度较小的8、9、10号峰构成西青果的突出特点。第Ⅲ区（12～15号），特征峰最突出的是13号峰（诃黎勒酸），12号峰13号峰14号峰15号峰。共有指纹峰面积比除诃黎勒酸参照物峰外，7、11号峰共有指纹峰面积超过总峰面积的10%,规定相对峰面积比值：7号峰为0.24～0.44,11号峰为0.24～0.45。8.西青果液相色谱指纹图谱主要色谱峰的光谱特征及LC/MS鉴定利用高效液相色谱的在线DAD检测器,测定主要色谱峰的光谱，给以定性鉴别的信息。经液相色谱-质谱联用测定，确定了7个峰归属,即1号峰为没食子酸-D葡萄糖苷,3号峰为没食子酸，4号峰为punicalagin，5号峰为Terchebulin，11号峰为Chebulamin，13号峰为诃黎勒酸,15号峰为诃子酸。指纹图谱特征峰基本是酚酸类成分，高保留成分为没食子酸等。这含药材鞣质类成分高达3.5％相符。