质粒目的基因插入及引物设计流程

一.寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）1.选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基；2.注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长，则说明CDS序列稳定可用；将查到的CDS序列粘贴至newDNAfile框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该段序列中的可能酶切位点二.登录=search-product找到质粒的全序列同样将该质粒序列粘贴至软件中，比较目的基因和质粒的多克隆位点（即酶切位点）1.质粒选择酶切位点的原则：目的基因上不能存在将要使用的酶的酶切位点，否则目的基因会被切掉；2.质粒上选择酶切位点应该尽可能短，为将来其他可能的克隆预留位置，如本实验质粒选择Aflll和BamH1，目的基因上均不存在酶切位点，实验室也买了，可用：选中目的基因序列，复制在AflI后至BamHI前的序列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HAtag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询：三.克隆引物设计1.电脑设计：回到NCBI的primerblast，拷贝目的基因CDS序列(共1602个碱基)，在框中输入|a|和CDS序列，并在Min和Max分别输入1602（表示blastCDS全部基因）；2.手工设计：遵循GC尽量少，Tm尽量小的原则，5端后选20个左右；3端从酶切位点终点往前数59个，因为除去CDS框的20个碱基后还要包括HA位点和酶切位点序列。5端引物序列即为atggctgtggagtcccag，但是还要再加上一段保护碱基AAATATATCTTAAG最后可得Forwardprimer为AAATATATCTTAAGatggctgtggagtcccagtcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct目的基因的20个碱基3端引物设计的起点（不含BamHI酶切位点）和方向最后要把引物顺序调整过来，点击“5→3”既得Reverseprimer序列tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct，同样在5端位置需再加上一段保护碱基AAATATATGGATCC最后Reverseprimer序列为AAATATATGGATCCtcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct构建表达载体的一般流程：设计primer(如上所述，综合考虑HA，CDS序列)→合成引物→选择合适的样本细胞（本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶，因此最好选择肝脏细胞系），提取mRNA并逆转录成cDNA→用设计的primer扩增目的基因（UGT1A1）→琼脂糖凝胶电泳→切胶回收特异条带→目的基因与质粒酶切结合，转染细菌扩大培养→提取质粒，测序判断质粒是否成功构建→建立稳定转染的细胞系→筛选药物