第5次课天然产物研究实验室技术3(结构鉴定)

•结构研究是天然药物化学的一项重要的研究内容。从天然药物中分离得到的单体即使具有很强的活性与较大的安全性，但如果结构不清楚，则无法进行进一步的药效学、毒理学、药物构效关系的研究，更不能进行人工合成或结构修饰，改造工作，也不能进行新药开发，其学术和应用价值将会大大降低。•天然化合物结构研究难度较大：⑴“未知”因素太多;⑵得量少；⑶结构复杂。因此主要借助于光谱方法进行综合解析，必要时结合化学降解，衍生物合成等方法。天然药物结构研究方法一、化合物的纯度测定1.检查晶形2.测定熔点3.TLC或PPC检查：一般需要三种系统，且需用通用显色剂显色（如硫酸、磷钼酸等）。4.GC或HPLC程序方法1.注意观察样品在提取、分离过程中的行为。初步判断化合物类型2.测定有关理化性质，如不同pH、不同溶剂中的溶解度及层析行为，灼烧试验、化学定性反应等。3.结合文献调研1.分子式测定可采用下列某种方法：①元素定量分析＋分子量测定测定分子式，计算②同位素峰法不饱和度③HR-MS2.计算不饱和度1.官能团定性及定量分析确定分子中含有的官能团2.测定并解析化合物的有关光谱：如UV、IR、MS、或结构片断，或基本骨架1HNMR、13CNMR3.结合文献调研①综合分析光谱解析及官能团定性，定量分析结果推断并确定分子的平面结构②与已知化合物进行比较或化学沟通（化学降解、衍生物制备或人工合成）。4.进一步确定立体结构推断并确定分子的立①测定CD或ORD谱体结构（构型、构象）②测定NOE或2DNMR谱③进行X-ray④人工合成二、结构研究的主要程序已知化合物：与标准品对照：共薄层（三种以上系统）：Rf值相同共熔点共红外无标准品：与文献数据对照mp,IR,UV,MS,1HNMR,13CNMR未知化合物确定分子式、分子量：元素分析、质谱、1HNMR、13CNMR谱功能基、基本骨架和结构式确定：1、定性反应2、反应薄层3、化学反应3、波谱法三、结构研究中采用的主要方法（一）确定分子式，计算不饱和度1.元素定量分析＋分子量测定元素定量分析：确定实验式如果化合物仅含C、H、O时，通常只作C、H定量，O则由扣除法求得。以刺果甘草皂苷元A为例进行说明：C79.35%，10.21%，则O=(100-79.35-10.21)％＝10.44%原子比C=79.35÷12.01=6.6110.16H=10.21÷1.008=10.1315.58O=10.44÷16.00=0.651得化合物原子比＝C10H16O1实验式：C10H16O1理论值：C：79.29%；H：10.13%；O：10.57%实测值：C：79.35%；H：10.21%；O：10.44%分子量测定：冰点下降法（固体物质）、沸点上升法（液体物质）、粘度法、凝胶过滤法，最常用质谱法（MS）。EI-MS测得分子量为496，即（C10H16O）×n=496，n=496/152=3，分子式C30H48O3。2.同位素峰度比法一定的化合物其[M]+,[M+1]+,[M+2]+峰的强度为定值。3.高分辨质谱（HRMS）法可将物质的质量精确测定到小数点后第3位，因此每一个化合物，即使有相同的分子量，其测得的精确分子量都不相同，以此可求得分子式。化合物分子式精确质量M1C8H12N4164.1063M2C9H12N2164.0950M3C10H12O2164.0837M4C10H16N2164.13154.不饱和度的计算：C25H30O15CnHmOvu=25-30/2+0/2+1=11HOHOHOHHOOOHOOHOHOHHOOHHOHOHHHHOHu=IV-++12IIII2u=2n+2-m2225+2-30u==112天然产物结构鉴定主要波谱方法：紫外光谱红外光谱质谱核磁共振谱旋光谱圆二色谱X-射线衍射一、紫外光谱（UV,Ultra-VioletSpectrometry）原理：有机分子吸收紫外光（200-500nm）后产生电子振动而形成的吸收光谱。应用：主要用于测定分子内的共轭系统。1、饱和烃：无紫外吸收2、不饱和脂肪烃：孤立双键：200nm共轭双键：＞200nm3、芳环：取代苯环＞200nm黄酮类化合物386MeONa200300400500268333MeOHOOOMeRha(1-2)GlcOMeOOH二、红外光谱（IR,Infra-redSpectrometry）原理：有机分子吸收红外光（500~4000cm-1）后产生化学键振动而形成的吸收光谱。作用：功能基的确定，如羰基、双键、芳环等应用：未知物鉴别、化学结构确定化学反应检查、区别异构体纯度检查、质量控制环境污染监测等NCH3HOOCOCHCH2OH消旋山莨菪碱OHAromaticringC=O特征区：4000~1250cm-1特征峰疏，易辨认确定功能基团＞3000cm-1OH、NH2、COOH~2900cm-1C-H伸缩振动1900-1650cm-1C=O伸缩振动1690-1600cm-1C=C伸缩振动1000-650cm-1C-H弯曲振动烯或芳环取代情况指纹区：1250~400cm-1吸收峰密集，结构微小变化敏感区别两个化合物是否相同三、质谱（MS,MassSpectrometry）原理：样品在质谱仪中生成阳离子，在稳定磁场中按质核比（m/z）顺序进行分离，通过检测器纪录下来。质谱法可以给出化合物的分子量，根据裂解碎片可以推断化合物的结构。用途：元素分析，分子量测定，分子式确定，糖、苷分子中单糖的连接顺序。质谱的种类：1.EI-MS：电子轰击质谱Electronimpactionization2.CI-MS：化学电离质谱Chemicalionization3.FI-MS：场致电离质谱Fieldionization4.FD-MS：场解析电离质谱Fielddesorptionionization5.FAB-MS：快速原子轰击电离质谱Fastatombombardmentionization6.ESI-MS：电喷雾电离质谱Electrosprayionization7.MALDI-MS：基质辅助激光解析电离质谱8.API-MS：大气压电离质谱1.电子轰击质谱（EI-MS）electronimpactionization样品经高温（300C）气化，气态分子受一定能量的电子冲击而电离和裂解产生各种阳离子。分子离子峰；碎片峰。应用：苷元、易气化的小分子EI-MSM+2.场解析质谱（FD-MS）原理：样品不经气化与载体表面形成薄膜，在强电场作用下电离为阳离子。应用：难挥发，热不稳定的糖、肽等3.快原子轰击质谱（FAB-MS）原理：样品与甘油混合由载体引入，分子经快速原子氩轰击后进入质谱仪。应用：高分子、热不稳定、强极性的糖、肽等CH2=CH2m/z28[M]+M-rhaM-rha-glcM-rha-rha-glcM-rha-rha苷元FAB-MS[M+1]+四、核磁共振谱（NMR,NuclearMagneticResonance）常用氘代溶剂杂质峰及水峰1.1HNMR通过化学位移（δ），积分曲线高度以及裂分情况可以判断分子中1H的类型，数目及相邻原子或原子团的情况，对有机化合物的结构测定具有重要的意义。（1）化学位移：不同类型的1H核磁共振信号将出现在不同的区域，据此可以进行识别。类型δ，ppmCH－C－CH30.8~1.2－C－CH2P1~1.5－C－CH1.2~1.8R－CH(α)－CH(β)α-H:+2~4(R=OH,OCOR,OR,NO2,X)β-H:+1~2R－CH(α)－CH(β)α-H:+1~2(R=C=O,C=C,Ar－)β-H:+0.5~1≡CH2~3=CH5~8Ar－H6~9－CHO9~10活泼氢（OH,SH,NH)不定，加入D2O后消失（2）峰面积：氢的数目（3）信号的裂分:偶合常数（J）s（singlet，单峰）d（doublet，二重峰）t（triplet，三重峰）q（quartet，四重峰）m（multiplet，多重峰）信号的裂分符合n+1规律CH2CH2OCH3OHCH2CH2CH3HHHHH2.核磁共振碳谱（13C-NMR）13C信号的裂分：符合n+1规律q（CH3）、t（CH2）、d（CH）、s（-C-）。基团C(ppm)基团C(ppm)CH3-伯碳0~30Ar(芳环)110~135CH3-O-40~60Ar-y(取代芳环)123~145-CH2-O-40~70-COOR（酯）155~175CH-O-60~76-CONHR(酰胺)158~180CH-(叔碳)31~60-COOH158~185C(季碳)36~70-CHO175~205-CC-70~100、-不饱和醛175~196C=C110~150、-不饱和酮180~213常见13C-NMR谱类型及其特征：①噪音去偶谱（protonnoisedecouplingspectrum），全去偶（protoncompletedecoupling,COM）或宽带去偶（broadbanddecoupling,BBD）。特点：所有C信号均作为单峰出现照射1H核，将产生NOE效应从而使观测核的信号强度增强，DEPT就是通过极化转移检测增强的13C信号。DEPT通过改变对1H核的第3个脉冲宽度（），使设定分别为45、90和135来区别碳原子的种类，分别得到只有甲基（CH3）、亚甲基（CH2）和次甲基（CH）信号的图谱。②DEPT(distortionlessenhancementbypolarizationtransfer)：3.二维核磁共振（2D-NMR）•1H-1HCOSY•13C-1HCOSY，HMQC•远程13C-1HCOSY，HMBC•NOESY•TOCSY同一自旋偶合体系里质子之间的偶合相关，对角线上出现的是一维1H-NMR的投影，对角线以外信号称为交叉峰或相关信号，处于两个轴上质子信号的水平和垂直连线的交叉点上，表明对应的质子间相互自旋偶合。（1）1H-1HCOSY（correlationspectroscopy23CH3O12345678910AB（2）13C-1HCOSY相关C-HCOSYHMQC：异核多量子相干谱（heteronuclearmultiplequantumcoherence）直接键连的C-H间的偶合相关，一般谱图中X轴为13C化学位移，Y轴为1H化学位移，交叉峰出现在相应的13C和1H信号的垂直和水平连线的交叉点上。13C-1HCOSY检测13CNOHOOOHMQC（HSQC）检测1H（3）远程C-H相关远程13C-1H相关（LongRange1H-13CCOSY）HMBC：异核多键相干谱（HeteronuclearMultipleBondConnectivity）提供两键或大于两键，主要是三键的C-H偶合信息，抑制了直接偶合信息（1JCH），建立C-C间的关联，甚至越过氧、氮或其他原子的官能团间的关联，特别解决由于屏蔽效应难以解释的季碳归属问题。NOHOOO（4）NOESY（NuclearOverhauserEffectSpectroscopy）检测质子之间通过空间的偶极相互作用（即NOE），可以建立核与核（相距不超过2.5Å）通过空间的连接关系以及原子在空间的位置关系，也可以提供有关分子的立体化学的信息。NOESY：two-dimensionalnuclearOverhausereffectcorrelationspectroscopy,二维核欧沃豪斯效应谱NOESYspectrumGlc-13-OMe7-OMeH-2H-4H-8H-5OOHHOCH3HHOH3COHOOOHOrhaOHCH2OHH24581'OOHO2458利用NOE技术确定C-12和C-20构型C-12(S)和C-12(R)：IR、MS、1HNMR、13CNMR几乎一样Neo-clerodan-20,12-olideneo-clerodane-lactoneC-20,C-12hemiacetalicfunction12(S)H-