联合监测血清IL-23dectin-1受体在早期诊断肺部真菌感染中的临床意义

1宁波市自然科学基金项目可行性报告联合监测血清IL-23、dectin-1受体在早期诊断肺部真菌感染中的临床意义一.立项的背景和意义：随着广谱抗生素、免疫抑制剂、糖皮质激素、化疗药物等在临床上的广泛应用以及器官移植、机械通气等生命支持技术的开展，深部真菌感染率呈增长趋势，而肺部由于直接与大气相通，且全身血流均经过肺循环，所以与其他器官相比，在深部真菌感染中侵袭性肺部真菌感染（invasivepulmonaryfungalinfections,IPFI）最为常见。IPFI多发生在有严重基础疾病的患者，其预后差，病死率高，其中念珠菌病病死率达30%-40%，曲霉菌病病死率达50%-100%，在大器官移植患者中肺部侵袭性真菌感染已成为患者死亡的重要原因【1、2】。深部真菌感染的疗效及转归很大程度上取决于早期诊断、早期规范治疗。尽早诊断对深部真菌感染的治疗和预后有重要作用。长期以来，IPFI的诊断主要依靠观察患者临床症状、微生物实验室检查、组织病理学检查以及宿主因素进行综合判断，但患者临床症状缺乏特异性且被细菌感染所致的原发病变所掩盖而不易识别。微生物学实验室检查主要包括直接涂片和真菌培养两种方法，前者是最经典的方法，简便、快速，但阳性率低，且不易识别是定植菌或污染菌。真菌培养虽然可以明确到种，还可做药敏试验，指导临床用药，但其检测周期长且不易识别是定植菌或污染菌。组织病理学检查是真菌感染诊断的“金标准”，但其属于创伤性诊断技术其应用受到病情的限制，同时其阳性率可受操作者技术水平的影响，且该方法的周期较长，可造成诊断的延迟和病死率的增加。近年来，一项新的血清学检测指标血清1、3-β-葡聚糖经美国FDA批准用于具有侵袭性肺部真菌感染症状或危险因素的患者作为IPFI的早期辅助诊断，但该指标不能用于隐球菌及接合菌的辅助诊断，同时其应用价值仍需临床进一步研究。因此寻找一种安全、快速、敏感及特异的免疫学指标对IPFI作出早期诊断显得极为重要。dectin-1受体作为固有免疫的重要组成部分，在IPFI的发生机制中起着重要的作用。采用流式细胞仪对患者外周血单核细胞中dectin-1受体的检测，同时结合患者血清IL-23水平有望对IPFI作出早期诊断，从而及早采取诊治措施。本课题主要研究大鼠2肺部被真菌感染后，外周血及病变组织单个核细胞中dectin-1受体的表达及血清IL-23水平与IPFI发生及病变程度的关系，评价dectin-1在IPFI中的实验室早期诊断价值。二.国内外研究开发现状和发展趋势（包括知识产权状况）：肺部真菌感染是一种严重危害患者身体健康的疾病，其临床表现无特异性，早期诊断困难，病情常被原发病掩盖，容易漏诊、误诊，延误最佳治疗时机。同时抗真菌药物不合理使用现象时常发生，因此肺部真菌感染的早期诊断已经成为迫切需要解决的临床问题。肺部真菌感染的发生与病原体的致病力、宿主防御力等因素密切相关。尽管对于其中涉及的许多机制尚不完全明确，但近些年的研究表明宿主与真菌接触后通过C型凝集素受体识别自己和非己的过程是机体发生固有免疫的基础。dectin-1受体作为C型凝集素受体家族的一个重要成员在IPFI的发生机制中起着重要的作用。C型凝集素受体（CLRs）是一个庞大的蛋白超家族，含一个或多个结构相关的C型凝集素杨结构域（CTLD）。依据结构和种系发生不同，CLRs被分为17个型，已有的研究表明，几种胞外和跨膜CLRs，包括树突状细胞相关C型凝集素-1（dectin-1）、dectin-2、DC-SIGN、甘露糖受体和胶原凝集素与抗真菌免疫有关，这些受体介导对真菌的黏附、摄取和杀灭，激起和（或）调节机体的免疫反应。dectin-1受体是由C型植物血凝素样碳水化合物识别域、短杆和具有免疫受体酪氨酸激酶活化基序（ITAM）的胞质尾部构成[3]。其C型植物血凝素折叠结构与自然杀伤T细胞类似，缺乏参与钙离子调节的残基，因而与钙离子依赖性C型凝集素结合碳水化合物相比，dectin-1受体结合配基呈非金属离子依赖性。最初的研究认为dectin-1受体是树突状细胞特异性受体，但后来发现dectin-1受体还广泛表达于单核巨噬细胞系统、中性粒细胞和成纤维细胞等[4]。研究发现dectin-1受体在脑、肌肉和皮肤以外的大多数组织中均有表达，以肝、肺和胸腺表达水平最高[5]。真菌细胞壁主要由碳水化合物（如β-葡聚糖、甘露糖）、蛋白质和脂质组成，β-葡聚糖很特殊，在哺乳动物细胞不表达，这种碳水化合物能够作为潜在的生物反应调节物起作用，对免疫系统起到多种作用，如抗肿瘤活性、抗感染活性（包括抗真菌、细菌、病毒、原虫感染等）[6]。吞噬作用在控制真菌感染中起关键作用，是3清除真菌病原体的重要机制。dectin-1受体作为β-葡聚糖的主要受体能够结合多种真菌，包括酵母菌、白色念珠菌、卡氏肺囊虫、隐球菌和曲霉菌等[7]，介导对真菌的吞噬作用。最近的研究发现它还能介导巨噬细胞对分枝杆菌感染的应答[8]。致炎介质（细胞因子和趋化因子）的产生，是控制真菌感染的必需早期步骤，致炎介质产生的缺陷将导致对真菌病原体敏感。dectin-1受体识别β-葡聚糖后，能够通过其胞质内免疫受体酪氨酸激活样基序介导细胞内信号转导，调节细胞因子和趋化因子的产生，包括INF、巨噬细胞炎症蛋白2、IL-2、IL-10、IL-6和IL-23等。Brown[9]认为前炎症因子和趋化因子的产生，需要TLR发热协同作用。但随着进一步的研究发现通过dectin-1受体的信号能够直接偶连适应性免疫应答[10]。另外，dectin-1受体在与β-葡聚糖结合后能诱导氧爆发，这是吞噬细胞的主要杀菌机制，对真菌杀伤是必需的，尽管Fc受体介导的调理素识别机制也能够诱导氧爆发，但dectin-1受体显示出更为显著的作用。白介素-23（IL-23）是近几年发现的一种白细胞介素，与白介素-12（IL-12）有40%的基因同源性[11]，由p19和p40两个亚基组成的二聚体，主要由活化的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞产生。IL-23可以对多种细胞发挥作用，促进细胞因子的分泌，产生相应的细胞效应，从而在抗真菌感染免疫机制中起着重要的作用。LeibundGut-landmann等[12]和ShinobuSaijo[13]等的研究表明dectin-1受体可诱导树突状细胞成熟并分泌促炎性细胞因子IL-6、TNF、IL-23以及IL-12的分泌,产生的IL-23可诱导辅助型T细胞17分化产生白介素17（IL-17）。IL-23通过诱导Th17细胞分化产生IL-17在抗真菌感染中起着重要作用。Contin等[14]使用小鼠口咽念珠菌感染模型研究发现，Th17细胞通过IL-17在抗念珠菌感染中发挥着重要的作用。KleinschekMA等[15]研究发现IL-17在真菌感染中参与了保护性免疫应答如系统性新型隐球菌感染，RunderKL等[16]的研究也表明了IL-17参与了对抗卡氏肺囊虫的宿主防御反应。而ZelanteT等[17]使用胃肠道白念珠菌感染和肺曲霉病小鼠模型研究发现，增高的IL-23/Th反应使小鼠对白念珠菌和曲霉菌的易感性增加，IL-23/IL-17途径抑制了保护性的Th1型抗真菌反应，起到了负调节的作用。总之dectin-1受体通过它的识别作用、介导细胞内摄作用、对β-葡聚糖促炎症反应的诱导作用（诱导树突状细胞成熟并分泌促炎性细胞因子IL-6、TNF、IL-23），4L-23通过诱导Th17细胞分化产生IL-17，在抗真菌免疫的机制中起着重要的作用。目前对于dectin-1受体在抗真菌免疫的作用，主要集中于临床治疗性药物设计靶点的研究，而对于其在真菌感染尤其是IPFI早期诊断中的价值，尤其是联合监测两者在IPFI早期诊断中的价值国内外目前相关报道甚少。参考文献[1]NucciM,MarrKA.Emergingfungaldisease[J].ClinInfectDis,2005,41;521-526.[2]FridkinSK.Thechangingfaceoffungalinfectionsinhealthcareseltin[J].ClinInfectDis,2005,41;1455-1466.[3]AriizumiK,ShenGL,ShikanoSetal.Identificationofanovel,dendriticcell-associatedmolecule,Decitin-1,bysubtractivecDNAcloning.JBiolChem,2000,275(26):20157[4]SobanovY,BernreiterA,DerdakSetal.Anovelclusteroflectin-likereceptorgenesexpressedinmonocytic,dendriticandendothelialcellsmapsclosetotheNKreceptorgenesinthehumanNKgenecomplex.EurJImmunol2001,31(12):3493[5]TaylorPR,BrownGD,ReidDMetal.Thebeta-glucanreceptor,Dectin-1,ispredominantlyexpressedonthesurfaceofcellsofthemonocyte/macrophageandneutrophillineages.JImmunol,2002,169(7):3876[6]BrownGD,GordonS.Fungalbeta-glucansandmammalianimmunity.Immunity,2003,19(3):311[7]TaylorPR,TsoniSV,WillmentJA,etal.Dectin-1isrequiredforbeta-glucansrecognitionandcontroloffungalinfection[J].Natimmuol,2007,8(1):31-38[8]SchoreyJS,LawrenceC.ThepatternrecognitionreceptorDectin-1:fromfungitomycobacteria[J].CurrDrugTargets,2008,9(2):123-129[9]BrownGD.Dectin-1:asignalingnon-TLRpattern-recognitionreceptor[J].NatRevImmunol,2006,6(1):33-34[10]WillmentJA,BrownGD.C-typelectinreceptorsinantifungalimmunol[J].Trends5Microbiol,2008,16(1):27-32[11]OppmannB,LesleyR,BlomB,etal.Novlep19proteinengagesIL-12p40toformacytokineIl-23,withbiologicalactivitiessimilaraswellasdistinctfromIL-12[J].Immunity,2000,13(5):715-725[12]LeibundGut-landmannS,GrossO,RobinsonMJ,etal.SYK-and-CARD9-dependmentcouplingofinnateimminitytotheinductionofThelpercellsthatproduceinterleukin17[J].NatImmunol,2007,8(6):630-638[13]ShinobuSaijo,YoichiroIwakura.Dectin-1andDectin-2ininnateimmunityagainstfungi[J].IntImmunol.,2011,23(8):467-472[14]ContinHR,ShenF,NayyarN,etal.Th17cellsandIL-17receptorsigna