胚胎干细胞的应用

胚胎干细胞研究现状及应用前景摘要：作为一类既有自我更新能力，并具有多向分化潜能的细胞，胚胎干细胞具有非常重要的理论研究意义和临床应用前景[1]。胚胎干细胞已被广泛用于生命科学的许多领域,它潜在的医学应用也成为世界范围内的研究热点。本文主要概述了目前胚胎干细胞在基础研究及临床上应用的研究进展并展望了今后研究的方向。关键词：胚胎干细胞生物特性克隆应用干细胞是一类具有自我更新和无限分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞，特别是胚胎干细胞是当前国内外医学和生物学领域研究的重点。胚胎干细胞(EmbryonicStemCells，ESCells)是由早期胚胎内细胞团(Innercellmass，ICM)(桑葚胚，囊胚)或原始生殖细胞(Primordialgermcells，PGCs)经体外分化抑制培养筛选出的一种多潜能细胞。胚胎干细胞可以在体外稳定的自我更新，可以在长时间继代培养后仍维持正常的二倍体染色体结构；具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，在一定的条件培养下，它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，例如：人类ES细胞可以分化为肌细胞、神经细胞[2]、内皮细胞、造血干细胞、骨髓细胞等，并可进一步形成机体所有组织、器官参与个体的发育过程，可称为是打开人类胚胎发育大门的一把“万能钥匙”。1.胚胎干细胞的生物学特性1.1胚胎干细胞的形态生化特性胚胎干细胞都具有相似的形态特点，与早期胚胎细胞相似，细胞较小，核质比高，细胞核明显，有一个或多个核仁，染色质较分散，细胞质内除游离核糖体外，其他细胞器很少；体外培养细胞呈多层集落状生长，紧密堆积在一起，无明显细胞界限。细胞的染色体均为稳定的二倍体核型。胚胎干细胞表达早期胚胎细胞的表面抗原，转录因子Oct-4为目前广泛用于鉴定胚胎干细胞是否处于未分化状态的一个重要的标记分子。研究发现，它最早表达于胚胎8细胞时期，一直到细胞发育至桑椹胚时期，在每个卵裂球中都可检测到大量的Oct-4的表达产物，这之后Oct-4的表达局限于内细胞团细胞。由此可见，Oct-4为细胞是否具有多能性的一个标记分子。另外，还有一些其他的标记分子，如碱性磷酸酶、Genesis、TRA-1-60、TRA-1-81、CD30等。1.2胚胎干细胞的增值胚胎干细胞能够自我更新而不分化，即经过不断地细胞分裂，增加干细胞的数量却始终保持着未分化状态。胚胎干细胞的分裂方式有两种：对称性细胞分裂与不对称性细胞分裂。所谓对称性细胞分裂是指干细胞每经过一次细胞分裂周期后，产生与母细胞相同的两个子代干细胞；而不对称性细胞分裂是指干细胞每经过一次细胞分裂周期后的两个子代细胞，其中一个仍然维持干细胞状态，另一个则形成干细胞和终末分化细胞的中间细胞类型，称祖细胞,祖细胞则失去自我更新能力，但可以分化成多种组织细胞。胚胎干细胞究竟采取那种分裂方式，与它所处的微环境有关，在自我更新的组织中干细胞即可分化成两个干细胞，又可形成两个分化细胞；当组织处于稳定状态时，往往进行不对称分裂。目前，科学家们正致力于明确在什么样的培养环境中，使胚胎干细胞可以成百倍的分裂而不分化。1.3胚胎干细胞的定向分化当前，胚胎干细胞研究的一个主要目的就是按照人的意愿来控制人的干细胞株向特定的细胞转化，并将这些转化的细胞应用于临床治疗。目前，研究人员在胚胎干细胞定向分化中已取得了很大进展，如现在已经可以使人的胚胎干细胞定向分化为神经元、心肌细胞、血管内皮细胞、类胰岛细胞等。很显然，人们一旦掌握了胚胎干细胞定向分化的规律，必然引起生物医学领域的一场重大革命[3]。2.胚胎干细胞的研究状况2.1国外胚胎干细胞的研究状况目前国际干细胞研究有4大热点：胚胎干细胞建系及定向诱导成组织细胞的分子机制；成体干细胞横向分化的条件；各种组织的成体干细胞库的建立及临床治疗试验以及细胞移植的免疫排斥问题。国外已取得令人欣喜的成果有：成功建立胚胎干细胞体外培养系统，并发现人的血液干细胞可以横向分化为肝脏、神经等组织的细胞。在各种干细胞的研究与应用中，胚胎干细胞（简称ES细胞）最引人注目。最新的研究表明，利用胚胎干细胞自我更新、高度增殖和多向分化的能力，结合现代生物医学及工程技术，有可能使人类组织或器官的修复和替代的美梦成真。这个领域的研究几乎涉及人体所有的重要组织和器官，也涉及人类面临的大多数医学难题，如成分输血、意外损伤患者的植皮、关节置换，糖尿病患者的胰腺植入、心脏病患者的瓣膜置换、癌症患者的手术切除后组织或器官的替代，大剂量放化疗后的造血与免疫功能重建，肝、肾等重要器官损伤或功能衰竭后的置换，部分遗传缺陷性疾病的治疗等。由于研究对象来源的匮乏（主要取自人工流产的极早期胚胎，或是施行试管婴儿术时所剩余的胚胎）以及伦理道德的约束，人胚胎干细胞的体外研究一直是空白。这种状况在1998年末被打破。美国Wisconsin大学科学家Thomson借助G1、2和G2、2培养基，解决了早期胚胎对输卵管环境的依赖性问题，从而将新鲜或冰冻的人体外受精卵由4～8细胞阶段培养至胚泡期，经分离内细胞团后逐渐传代建立了人胚胎干细胞系。美国科学家John从人原始生殖细胞中建立了与人胚胎干细胞功能个似的多能干细胞系———胚胎生殖细胞系。这两个小组的研究结果在《科学》和《美国科学院院报》上一经刊出，立即在科学界引起极大的震撼，不仅掀起了新一轮的胚胎干细胞研究热潮，而且由于科学家利用人类干细胞系诱导胚胎干细胞分化为神经干细胞和心肌干细胞获得成功，使得胚胎干细胞应用于临床的研究产生了突破性进展。2008年1月美国加利福尼亚州从事干细胞研究的Stemagen公司采用克隆多利的技术来建立人体晶胚，首次宣布由人体细胞成功克隆人体胚胎，虽然这些比针头还要小的晶胚细胞只存活了5天时间，它们却被视为治疗阿尔茨海默症、帕金森氏症等疾病的一个里程碑。目前，科学家对胚胎干细胞定向诱导分化的机制尚不清楚，即还不明白胚胎干细胞接受谁的“命令”，此时分化为造血干细胞，而彼时又分化为神经干细胞或别的什么干细胞。这是干细胞工程进一步研究与应用面临的最大困扰。在胚胎干细胞向各种细胞分化的研究模型中，向造血细胞的定向诱导分化是最佳模型之一。为此，一段时间以来，我国科学家对造血干细胞的研究与应用投入了较大的精力，也取得了一些突出成绩。2.2国内胚胎干细胞的研究状况2002年重庆妇幼保健院生殖与遗传研究所完成了中国首例囊胚胎培养技术。该技术不仅大提高了试管婴儿的妊娠成功率，还有效地降低多胞胎发生率。美国哈佛大学医学院正与重庆妇幼保健院生殖与遗传研究所合作，人工共同研究干细胞的分化，为“克隆”人体器官创造条件。我国在“治疗性克隆”研究领域获得重大突破，“治疗性克隆”课题被列为国家级重点基础研究项目。此课题分为上、中、下游三块，上海市转基因研究中心成国祥博士负责上游研究，上海第二医科大学盛惠珍教授和曹谊林教授分别主持中、下游的研究工作。其整体目标是，用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经过一定的处理使其发育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎干细胞，在体外进行诱导分化成特定的组织或器官，如皮肤、软骨、心脏、肝脏、肾脏、膀胱等，再将这些组织或器官移植到病人身上。利用这种方法，将从根本上解决同种异体器官移植过程中最难的免疫排斥反应，同时还使得组织或器官有了良好的、充分的来源。目前，由上海市转基因研究中心负责的上游研究工作，即把病人的体细胞移到去核的卵母细胞并经一系列的处理发育至囊胚取得成功。这个中心创建的三种技术路线方法，即“体细胞克隆哺乳动物的制备方法”、“获得治疗性克隆植入前的制备方法”以及“用于治疗性克隆的人体细胞组织器官保存方法”均已收到国家知识产权局同意专利申请的受理通知。2009年2月2日山东省干细胞工程技术研究中心宣布首次成功克隆人类囊胚，此研究选择了健康卵细胞志愿捐献者12人，经过促排卵共获得135枚卵细胞，其中77枚卵细胞进行了预实验，58枚卵细胞用于实验，最终成功获取囊胚5枚。其中4枚囊胚的供体细胞来源于正常人皮肤纤维细胞，1枚来源于帕金森患者外周血淋巴细胞。因而，揭示了在构建胚胎发育过程中的部分科学和技术问题，这使治疗性克隆研究向前迈进了一大步。国内科学家普遍认为，我国的干细胞研究目前与国外先进水平非常接近，因此在国际上“挤占”一席之地是很有希望的。如果看准时机，通过政府出面调控企业适时介入，无论是学科进步还是产业化发展的前景都十分可观。我国政府已经将干细胞研究列入“973”项目、国家自然科学基金重点项目中[4]。3.胚胎干细胞的应用进展3.1ES细胞诱导分化为表皮样干细胞及其在皮肤修复方面的应用目前临床上对烧伤或创伤患者进行整形修复时主要是依靠自体皮肤的移植,但对于大面积严重烧伤或损伤的患者根本无法移植,只能让患者形成永久性疤痕。最早研究的永久性皮肤替代物为表皮细胞膜片,主要是采用自体或异体的角质形成细胞,在体外培养形成表皮细胞膜片,用来覆盖皮肤缺损,其不能形成皮肤附属结构。Bagutti等用悬滴培养法培养小鼠ES细胞形成拟胚体,于第2~15天及21天分别有细胞角蛋白CK8和CK19、CK10和CK14的表达,提示ES具有向表皮方向分化的潜能。撒亚莲等研究结果示人类ES细胞源性的表皮样干细胞具有分化为角化复层上皮、毛囊样、皮脂腺样和汗腺样结构的潜能,在ES细胞向皮肤细胞诱导分化方面取得一定进展。刘爱军等研究结果表明移植到创面的ES源性表皮干细胞存活,并向表皮分化,创面完全愈合后,检测出有特异性标记物的角化复层上皮、毛囊干细胞和汗腺,提示ES细胞源性表皮干细胞具有分化为毛囊和汗腺等结构的潜能,说明把ES细胞源性表皮干细胞直接植入到全层皮肤缺损创面,可能对修复表皮及皮肤附属结构起重要作用。以上实验成功地显示ES细胞具有向表皮样细胞诱导分化的潜能,并有希望应用于临床,移植到烧伤或创伤患者皮肤进行整形修复。3.2ES细胞诱导分化为神经细胞及其在神经系统疾病中的应用许多神经系统疾病实际上是由于神经细胞的缺失所致,这些细胞如果得不到新生细胞的补充,所形成的疾病就不可能治愈。2006年,Ueno提出了羊膜基质层基础上的胚胎干细胞诱导诱导方法,将打散的鼠ES细胞种植在明胶包被的人类羊膜基质层上,在无血清培养基里培养了1周之后形成集落,里面包含了大量Nestin阳性细胞和NCAM阳性细胞。通过此法可诱导生成各种类型的神经细胞,包括多巴胺神经元、运动神经元和视网膜色素上皮细胞。李彬等用人类ES细胞高效地分化得到了神经前体细胞。这种神经前体细胞具有多能性及与体内神经发育相似的模式和基因表达变化。将ES细胞诱导分化为神经细胞的研究,不但可以解释人类神经系统发育过程中的复杂事件,还可以提供可能的供体细胞来源用于细胞替代性治疗。在早期的ES细胞源的神经细胞移植实验中,植入鼠类模型脑中的神经元不仅具有功能活性,而且整合到宿主的脑中,在某些个案中甚至改善了神经退行性疾病的症状。Cummings等将人胚胎脑神经干细胞球移植到鼠损伤脊髓处,电镜观察到移植细胞与宿主神经元之间有突触形成,大鼠的运动功能也相应恢复。Lu等实验也证明移植神经干细胞能促进损伤脊髓功能恢复。以上关于ES细胞的研究,为神经系统疾病的治疗,提供了新的有效的方法,尤其是一些伴随脑或脊髓相应部位的特定神经元死亡的老年性疾病,通过诱导胚胎干细胞分化形成新的神经组织细胞并进行移植修复,有望治愈这些疾病。3.3ES细胞诱导分化为造血干细胞及其在造血系统疾病中的应用如今对于造血系统功能异常,如再生障碍性贫血、白血病等,随着医学进展,很多病例得到一定程度的缓解,但仍有相当的患者不能治愈,抑或出现治疗并发症等。胚胎干细胞定向诱导为造血干细胞的研究成果,可能为临床提供新的有效的治疗方法。人们先后采用了悬浮培养、半固体培养基中原位诱导、辅助细胞共培养以及分阶段诱导等多种方法成功地将ES细胞在体外诱导分化为造血各系细胞。张绪超等通过对含人AGM区基质细胞培养体系定向诱导ES细胞为造血干细胞的实验研究,得出人胚早期AGM区基质细胞能促进小鼠ES细胞定向分化为造血干细胞的结论,为研究ES细胞分化为造血干细胞的分子机制提供了实