脂溶性药物脂质体包封率研究进展

综述脂溶性药物脂质体包封率研究进展——王淑娟【摘要】脂质体的质量研究是脂质体研究中最为重要的一部分，其中一个重要的指标是包封率的测定。本文主要对脂溶性药物脂质体包封率测定方法及方法的可行性研究等近期研究进行了综述，并分析了现存的一些问题及适当的解决方法。为脂溶性药物脂质体的研究提供参考。【关键词】脂质体；脂溶性药物；包封率几十年来，脂质体作为新型药物载体以及生物膜模型的研究受到热切关注。这主要是基于脂质体既有亲水性又有疏水性，且作为药物载体与其他剂型相比，脂质体因其磷脂可生物降解、无毒、无免疫原性，生物相容性非常好，且结构上自我封闭，具有保护药物生物活性、有效的控制药物释放、提高稳定性、延长半衰期、提高疗效及降低药物毒副作用等诸多优点，被广泛研究，并用于动物体外和体内药物实验。很多脂溶性药物因其生物利用度低、毒性大或水中不稳定等特点，临床应用受到限制[1]。脂质体作为一个优良的药物载体，脂溶性药物可溶解于磷脂双分子层的夹层中，动态地增加难溶性药物的溶解度。药物的理化性质、脂质双分子层的构成及制备方法也会影响药物的溶解度[2]。脂溶性药物因其理化性质不同，脂质体的制备和检测方法多种多样，选择合适的制备方法和检测手段成为载药脂质体制备研究的一个重要部分。本文主要对脂溶性药物脂质体包封率测定方法及方法的可行性研究等近期研究进行了综述，并分析了现存的一些问题及适当的解决方法。为脂溶性药物脂质体的研究提供参考。一脂溶性药物脂质体制备方法当磷脂分散在水中形成多层囊泡，每一层都是磷脂双分子层，各层之间被水隔开，这种由脂质双分子层构成，内部为水相的闭合囊泡称为脂质体。无论何种方法制备，脂质体的形成都是由于磷脂-磷脂分子、磷脂-水分子之间亲水与疏水相互作用的结果。而引起磷脂分子重排，形成双分子层进而达到热力学平衡，最终形成脂质体的这一过程必须要有能量的供应[1]。传统脂质体的制备一般包括以下基本步骤：①磷脂、胆固醇等脂质及脂溶性药物先溶于有机溶剂，在一定条件下去吃出溶解脂质的有机溶剂使脂质干燥形成脂质薄膜；②使脂质分散在水溶液（或含有水溶性药物的水溶液）中水化形成脂质体。③纯化形成的脂质体。④对脂质体进行质量分析。对于脂溶性药物而言，由于脂质体膜内部是由非交联分子相互作用相关的分子组成的非常流动的脂肪族基质，它容易接受和保留大范围的脂溶性化合物而不需要任何固定点特异性化学结构。在一般正常情况下，这些化合物掺入浓度大约1%-10%（重量比）而不会严重破坏双层结构[3]。制备含药脂质体时,根据药物装载的机制不同可分为被动载药法与主动载药法两大类。所谓被动载药,即首先将药物溶于水相或有机相中,然后按所选择的脂质体制备方法制备含药脂质体,决定其包封率的因素为药物与磷脂膜的作用力、膜材的组成、脂质体的内水相体积、脂质体数目、分子量及药脂比等；所谓主动载药,即通过内外水相的不同离子或化合物梯度进行载药,主要有K+--Na+梯度和H+梯度（即pH梯度）等。传统上,人们采用最多的方法是被动载药法，对于脂溶性的、与磷脂膜亲和力高的药物,被动载药法较为适用[4]。脂溶性药物脂质体常用制备方法主要包括薄膜分散法、乙醇或乙醚注入法、有机溶剂分散法、反相蒸发法、机械匀质法、冷冻干燥法、冻融法、多相制备法、二次乳化法及表面活性剂增溶法等[5]。二脂溶性药物脂质体包封率的测定方法1离心法：根据脂质体与游离药物比重不同所受到的离心力不同,从而沉降速度不同,达到分离的目的,用来测定包封率。用离心法测定包封率分为低速离心和超速离心两种。低速离心适用于水溶性极差的药物脂质体分离，因不溶于水的药物在水相中容易形成微颗粒，使用低速离心可以将游离药物沉淀下来，而含药脂质体为纳米颗粒，不足以形成沉淀。因此使用低速离心法前，有必要对药物在水介质中溶解程度进行考察。杨瑞等人[6]认为紫杉醇在水中的溶解度很低，在低速离心条件下会以沉淀形式析出，故取制备好的脂质体5000r/min，离心10min，分离后测得包封率﹥90%。但作者并未测定游离药物在水介质中的溶解度，因此所测的包封率准确性有待考察。李琅琅等[7]制备了荧光红GG脂质体，荧光红GG为水不溶性药物，作者经实验摸索确定3000rpm•min-1离心10min，离心后上清为脂质体，沉淀为游离药物，测得平均包封率为12.08%。低速离心法具有操作简便,仪器要求低等优点。这种方法应用的前提是药物在缓冲液中的溶解度极小(小于投药量的5%),脂质体足够大。且离心速度和离心时间的正确选择也很关键，离心速度过小药物沉淀不完全,离心速度过大则含药脂质体被沉淀。对于较大粒径的脂质体，低速离心法不能准确的测定其包封率。超速离心法较适用于两种情况脂质体的分离：一是制备过程投药量很小，游离的药物基本溶解或在缓冲液中呈极小纳米粒状态；二是脂质体粒径相对较大，可以被完全离下来。梅之南等[8]制备的固体脂质纳米粒在100-200nm之间。测定药物包封率之前，先将雷公藤内酯醇固体脂质纳米粒混悬液加1mol/LHCl调至pH约1.2,使纳米粒凝聚,然后4℃、50000r/min超速离心30min,上清液为游离药物，沉淀为脂质体测得最大包封率为92.3%；QingguoXu[9]用hydroxyapatite羟磷石灰修饰的脂质体包裹疏水性药物，得到的脂质体粒径在200nm-400nm，采用15000r·min-1离心10min分离游离药物和脂质体，测得最大包封率为16.8%；金圣煊等[10]以30000g、4℃条件下超速离心1h来分离脂质体和游离的肉豆蔻酸酯,脂质体保持混悬状态,而游离的肉豆蔻酸酯则沉淀出来,结果测得包封率达到98%；孙晶等[11]制备的新型姜黄素脂质体，平均粒径97.08nm,经60000r·min-1离心1h分离脂质体和游离药物，测定包封率大于99%。作者还对分离后的沉淀和上清进行TLC分析检识磷脂，TLC结果证明上清中无脂质体，分离完全。许洁[12]制备的环孢素A脂质体粒径在100-200nm之间，采用超速离心法分离游离药物和脂质体，选择224000g离心60min,测得平均包封率为87.09%。超速离心法优点是操作简单，节省时间且测定结果准确。但其对设备要求高，根据不同脂质体粒径选择不同的转速，ETouitou等[13]报道150nm的脂质囊泡，采用40000r·min-1，3h才能将脂质体和游离药物完全分离。2葡聚糖凝胶柱层析法葡聚糖凝胶柱层析，又称葡聚糖凝胶过滤，属于分子排阻色潽法，利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大小的差异进行分离,脂质体的平均分子量约10-30万道尔顿，较广泛地用于小分子药物脂质体的包封率的测定。常用的葡聚糖凝胶[14]有SephadexG-50（Fractionationrange1000-30000）和SephadexG-25（Fractionationrange1000-5000），操作程序与脱盐和分离一样，先将溶胀好的凝胶装入柱子中,用洗脱液冲洗柱子至平衡后,将脂质体上柱洗脱。脂质体由于粒径较大先被洗脱下来,而游离的药物粒径较小,穿透到凝胶的内部空隙,较后被洗脱下来,使得脂质体与游离药物分开。当凝胶过滤法用于分离脂溶性药物脂质体时，应保证样品中无游离药物的微晶颗粒，否则可能导致药物微晶阻塞柱子难以洗脱或随脂质体一同洗脱出来，导致测得包封率不准。陈军等[15]凝胶SephadexG-50分离脂质体和游离的马钱子总生物碱。所用柱长27cm，内径1cm，ph7.4PBS洗脱，流速1mL·min-1,每份2ml,收集18份，，脂质体和未包封的游离药物可以实现完全分离，第1-7管为含药脂质体，第8-16管为游离药物。最后测得马钱子总生物碱脂质体平均包封率77%。徐昕等[16]选择SephadexG-50(25.0cm×0.8cm)分离脂质体和游离的蟾酥提取物，,以pH7.4的PBS缓冲液洗脱,洗脱速度为1mL·min-1,乳白色带接近柱口时开始收集,待其完全通过时停止收集,共约11mL,后续液约60mL。HPLC测得平均包封率95.54%。值得注意的是Polydextranbeads表面有许多位点能够与脂质体膜相互作用，可能导致脂质体小量丢失，当脂质体浓度低时，这种现象更明显。因此分离前，用适量空白脂质体预先饱和柱子，可以避免上述现象发生；当凝胶颗粒直径太小或胶床含有许多细小颗粒，较大的脂质体（0.4μm）有时会停留柱内。用于MLV层析的基质颗粒在50-150μm范围比细颗粒更好，而所有的各种直径颗粒凝胶都适于SUVs的层析[3]。高晓黎等[17]，用3种不同型号的葡聚糖凝胶,采用正交设计法,对测定替加氟脂质体包封率的条件进行了筛选,实验结果表明葡聚糖凝胶的径高比、洗脱流速、上样量都影响脂质体与游离药物的分离效果,且3种凝胶中以粒径为100～300μm的SephadexG-50最适于脂质体包封率的测定。葡聚糖凝胶过滤法优点在于其方法简单，设备要求廉价，样品回收率佳，分离效果较好。不足之处是其耗时较长，包括预装柱、柱平衡、预饱和等多个程序，且在样品洗脱过程中，脂质体容易被稀释和遭到一定程度的破损。文扬在[18]吡喹酮长循环脂质体的研究中，分别采用高速离心法、微型柱离心法及葡聚糖凝胶G-50来分离脂质体和游离药物，结果发现只有葡聚糖凝胶G-50能使两者完全分离。3微型柱离心微型柱离心法是一种快速简便的分离脂质体内外相中小分子药物（最好小于7000）的方法，适用于样品量小,小分子渗漏较快的包封率测定。它结合了葡聚糖凝胶柱的分子筛作用和离心法的加速分离作用，同时又减小对样品的稀释程度。微柱离心法常用的凝胶有Sepha-dexG-50（Fractionationrange1000-30000）和SephadexG-25（Fractionationrange1000-5000）。制备方法[3]是：①溶胀好的（至少5h）凝胶储存于4℃备用；②1ml注射器去芯后加入滤板防止凝胶脱落；将水化凝胶装满注射器；③将注射器装入13×10mm离心管，2000rpm/min离心3min除去多余缓冲液，柱床高达0.9ml刻度线位置；④取0.2ml未稀释的样品逐滴加入到微型柱顶端，如果脂质体加的过快，柱床完整易遭到破坏造成不完全分离；⑤2000rpm/min离心3min收集含脂质体的洗脱液；⑥加入0.2ml缓冲液漂洗微型柱，离心洗脱液中不含药物；⑦第二次加入0.1ml缓冲液，离心收集游离药物测定含量。该法的可行建立于样品不被凝胶填充物物理滞留的假设之上，应事先考察游离药物及含药脂质体的回收率。AllenZhang[19]制备了新型的低压冻干紫杉醇脂质体，粒径约150nm。采用SephadexG-25微型柱离心法分离脂质体和游离药物，之前用100μl空白脂质体预饱和柱子，1520g×15min离心除去多余空白脂质体。上样后1520g×15min离心分离脂质体和游离药物，HPLC测定包封率，J.AllenZhang认为SephadexG-25微型柱对紫杉醇脂质体分离效果佳，且回收率达到100%；刘丹[20]采用微柱离心法进行芹菜苏囊泡包封率的测定。取芹菜素囊泡加至经2000r·min-1离心处理后的SephadexG-50凝胶小柱中,用适量蒸馏水多次离心洗脱,收集前两管离心液,过滤后进样测定峰面积(A),计算包封率最高约60%。微型柱离心法优点很多，快速简便、适用于样品量小及小分子渗漏较快的包封率测定，尤其适合乙醇注入法制备的脂质体，因其避免了原本浓度较低的脂质体溶液被再次稀释而影响样品含量的测定。其缺点在于洗脱过程也对样品产生了一定的稀释，且葡聚糖凝胶微柱离心分离脂质体受较多因素影响。不同的脂质体或药物，洗脱时间存在差异，可能造成脂质体与游离药物分离不完全。王汀[21]等用微柱离心-药脂比法测定脂质体的包封率。首先用定磷法考察微柱以1000r·min-1离心1min对空白脂质体和载药脂质体的洗脱率均为30.6%,此时尽管载药脂质体没有全部洗脱出来，但游离药物全部留在柱内。取此洗脱下来的脂质体行药脂比测定，则测定洗脱液中的药脂比(定值)与起始