臭氧及相关技术在口腔诊疗污染控制中的应用

臭氧对口腔诊疗中可能的病毒杀灭作用研究目的：针对牙科治疗中不可避免的回吸效应所带来的乙型肝炎病毒交互感染问题，利用臭氧水动态、适时对牙科治疗台水系统进行消毒，使其菌丛含量达到美国牙科协会（ADA）的理想标准[1]，实现了口腔治疗用水的适时无菌化。方法：对20例已知的乙肝“大三阳”患者进行开髓等常规治疗操作结束后卸下手机，从手机连接管口接取水样、送检；将东线公司的动态水灭菌系统与牙科治疗台水系统结合，系统采取循环方式供水，使牙科治疗台管道内臭氧水的臭氧浓度保持在特定的浓度；并检测该浓度臭氧水对脊髓灰质炎病毒的杀灭效果。结果：实施水消毒前，手机连接管出水口水样PCR检测结果乙肝病毒DNA阳性7例；臭氧水与病毒作用30s，对病毒的杀灭率100%；臭氧水与正常细胞接触24h，正常细胞的生长未受到影响。结论：本方法是牙科治疗台水系统的高效消毒手段，是杜绝口腔科乙肝患者交互感染的切实可行的方法。未经消毒的牙钻是传播乙型肝炎等疾病的媒介[1]，这一点已成为人们的共识。在临床工作中牙钻手机与牙科治疗台水系统的手机连接管衔接，手机的回吸作用可以将患者口腔内的污染液体回吸入手机，并穿过手机内的中空管道进入手机连接管并污染治疗台水系统[2、3]。回吸是不可避免的物理现象，使用防回吸手机等措施，都不能取得满意的效果。因此，即便对牙钻手机实行了有效消毒灭菌之后，由于治疗台水系统的污染，牙钻作为媒介导致的医院内感染问题并未完全解决。现将解决本问题的方法报告如下。1.资料与方法1.1临床资料PE5700型荧光定量PCR仪（美国Perkinelemer公司），96孔微量细胞培养板（丹麦NUNC公司生产），乙型肝炎（HBV）荧光定量试剂盒（中山大学达按基因股份有限公司提供），脊髓灰质炎口服糖丸（北京天坛生物制品股份有限公司生产），Hep-2细胞（天津医科大学微生物教研室提供），1640细胞培养液（美国SIGMA公司生产），小牛血清（天津医科大学微生物教研室提供）。收集2003年2月~2003年7月在消化科和市传染病医院诊断的乙型肝炎HbsAg、HBeAg、HbcAb阳性患者，从中选择牙病牙痛患者20例，其中男14例，女6例，年龄24~43岁，平均29岁。1.2方法1.2.1牙科治疗台水系统乙型肝炎病毒污染水样的采集为每一患者配置一台口腔综合治疗台取样专用。排空治疗台内存水，拆下储水罐，15%过氧乙酸浸泡、清洗，生理盐水冲洗，重新安装到牙科治疗台并注入清洁的蒸馏水。拆下原来的手机连接管，用新的连接管替换。储水罐加入蒸馏水1.0L，启动脚踏开关，从手机连接管口排水3min，安放经合格灭菌的高速涡轮手机，为乙型肝炎患者进行常规治疗。用牙钻手机对该组患者进行开髓、备洞等常规治疗操作，操作结束后卸下手机，用无菌试管对准手机连接管口，启动机器，接取排出液体1-2ml，密封，送检。每次治疗取样结束后，卸下高速牙钻手机，排除手机管路内储水，用上述方法清洗、消毒储水罐，更换新的手机连接管，安装无菌手机，启动机器，排水3min，再为下一乙肝患者治疗取样。1.2.2乙型肝炎病毒的检测：取上述方法采集的水样40µl，加等量DNA提取液打匀，沸水浴10min，转至4℃静置8~12h。10,000rpm离心5min，取上清液5µl做PCR反应。反应循环参数：93℃2min。预变性：93℃45sec，55℃1min，反应10个循环，93℃30sec，55℃45sec，反应30个循环。结果分析：依据已知标准样品起始模板的对数值与Ct值的模板存在时，即得到反应核酸扩增的过程的S形动力学曲线。1.2.3.对脊髓灰质炎病毒杀灭效果的实验室检测方法根据卫生部最新颁布的《消毒技术规范》[4]，本项目用臭氧水对脊髓灰质炎病毒标样进行实验室杀灭实验替代对乙型肝炎病毒的杀灭实验。将含脊髓灰质炎病毒（V1-3型）的糖丸用1ml冷的灭菌蒸馏水稀释，取0.1ml接种于长成单层的Hep-2细胞上，病变达“+++”到“++++”时收获，然后连续传代2次，获得一定浓度的病毒悬液，用MTT法检测病毒悬液的滴度（TCID），并用1640培养基将病毒悬液稀释到TCID为102/ml时待用，将稀释后的病毒悬液和特定臭氧水1：1混合，作用不同时间（30s、60s、120s、180s），然后接种于细胞（Hep-2）长成单层的96孔板上，同时设细胞对照、细胞与臭氧水混合的对照及阳性对照，按细胞培养方法培养后，在显微镜下观察细胞形态，同时检测0.D值，以此来确定对病毒的杀灭效果。2.结果2.1对20例乙型肝炎患者的患牙治疗后，手机连接管出水口水样PCR检测结果，7例阳性（见表1）。2.2适当浓度臭氧水对脊髓灰质炎病毒杀灭效果的实验室检测结果：实验结果见表2实验结果表明：适宜浓度的臭氧水与病毒作用30sec，对病毒的杀灭率达100%；同时实验表明，适宜浓度的臭氧水与正常细胞接触24h，对正常细胞的生长没有影响。3.讨论在日常的牙科治疗中，口腔治疗台释出的水被大量的致病微生物和非致病微生物严重污染。近几年来，国内有关牙科治疗台水系统被致病菌严重污染的报道很多[5、6]。污染微生物除来源于供给治疗台的水源外，还来源于牙钻手机在患者口腔内停转时的回吸作用[2、3]。为证实手机的回吸作用，有人曾用重铬酸钾进行实验，证明手机的回吸物可进入治疗台水系统。但我们认为，染料与口腔内液体的粘稠度不同，也不含有致病微生物，没有活性和繁殖的可能。因此染料模型不能代表临床情况，其临床指导意义有限[7]。国内有人用乙型肝炎病毒颗粒进行实验研究发现，高速涡轮手机的回吸可将乙肝病毒颗粒回吸进入手机和储水罐[8]。本项目对乙型肝炎患者治疗后，对手机连接管水样进行临床取样并行PCR检测，获得了阳性结果。该结果可以证明，在临床治疗中，牙钻手机的回吸可以将患者口腔内含有乙型肝炎病毒的液体回吸，穿过牙钻手机污染治疗台水系统。我国是乙型肝炎高发国，乙肝病毒携带者为人群的9.75%。牙科日常就诊的病人中，乙型肝炎病毒阳性的患者为数众多，其口腔内的血液、唾液及牙髓引流物均含有乙肝病毒[1]。为此类病人治牙可能导致治疗台水系统乙肝病毒的污染，然后造成其他患者的感染的可能。即使患者在牙科治疗时被感染，但因乙肝病毒感染后会有很长的潜伏期，易被大家忽视。在潜伏期，感染者可能到其它医院接受类似的治疗，或可能经过多次不洁的理发、刮脸或在不洁的饭店饮食，会使感染的确认变的模糊和困难。爱滋病毒生命力弱于乙肝病毒，但我国的爱滋病传播速度并不亚于乙肝，05年上海就出现口腔医疗中发现爱滋病人的事例，这种病人就诊对患者和医生都存在感染可能。本项目研究中，PCR检测获得的阳性结果说明，阻断牙科治疗中乙肝病毒的传播，仅对牙钻手机进行消毒灭菌还不足以解决问题，必须使用具有动态消毒功能的供水系统，为治疗台水系统进行有效、适时的消毒处理。实验结果还表明，与正常细胞接触24h，对正常细胞生长无影响，实验结果与国外报道的臭氧水无细胞毒性或微小毒性相符[12]。国外还有臭氧无过敏反应，皮肤无累积性刺激的相关报道。因此，本研究设计的方法，作为牙科治疗台水系统的有效消毒手段，是杜绝病人通过治牙造成乙肝病毒交互感染的现实可行的方法。臭氧对于细菌与生物膜杀灭作用的研究目的：牙科治疗台水管路污染可形成生物膜及回吸现象。为获得牙科治疗台水系统水质污染情况的第一手准备数据，采用有效的消毒方法，彻底阻断治疗台水污染为媒介的交互感染。方法：随机采集牙科治疗台各部位的水样，计数检测细菌污染的菌丛含量，对培养后污染细菌的种类进行鉴定；采用循环、适宜浓度的臭氧水作为消毒剂，检测实验室与临床消毒效果；观察适宜浓度的臭氧水与正常细胞接触24h后细胞形态变化。结果：消毒前，牙科治疗台水系统被大量的致病和非致病微生物严重污染，细菌污染均数为每毫升水样1.58万-4.47万菌丛（cfu/ml），这些异样菌在牙科治疗台水系统内部以多种形式的生物膜生长；消毒后，牙科治疗台水系统内细菌含量为0，无生物膜形成；适宜浓度的臭氧水与正常细胞接触24h，对细胞的生长无影响。结论牙科治疗台水系统污染情况严重，手机连接管内的生物膜为重要污染环节；适宜浓度的臭氧水可以对牙科治疗台水系统实现适时无菌化处理。1.材料和方法1.1临床取样：随机选择日常应用的牙科综合治疗台6台，于每日晨开诊前采集水样，连续取样6天。1.1.1.储水罐内水样采取：打开储水罐注水口，用无菌移液管深入水罐下部，吸取罐内存水10ml，将取出的储水罐内水样置于无菌三角瓶内，封口，送检。1.1.2.手机连接管水样采取：用酒精灯烧灼消毒手机连接管金属出水口,启动治疗台脚踏开关,用无菌三角瓶接取水样10ml，封口，送检。1.1.3.三用枪出水水样采取：用酒精灯烧灼消毒三用枪，开启三用枪出水，用无菌三角瓶接取水样10ml，封口，检测。1.1.4.生物膜的采取：①储水罐内生物膜的采取：打开储水罐上口，用无菌接种环刮取黏附在罐壁上的絮状碎片；②手机连接管生物膜的采取：启动治疗台脚踏开关，用手指在手机连接管末端（连接管的近手机端）间断加压，可见与连接管内径和形状一致的套袖状生物膜从水道内脱出。1.2污染水样的细菌学检测：无菌操作，将污染水标本接种在普通琼脂血平板和MCK平板上，37℃，24~48h，根据菌落形态，G染色、氧化酶初步鉴定，再根据生化反应（采用法国梅里埃中国有限公司提供的微量生化反应系统）进一步对细菌做鉴定。生物膜标本于显微镜下观察。1.3.对牙科治疗台水系统行动态消毒的实施方法：将东线公司水灭菌系统与牙科治疗台水系统连结（图）。由于臭氧水特殊的物理特性，系统设计去除原牙科治疗台的储水罐，用一个总储水罐，以泵为动力，采用循环供水的方式；系统自动调整臭氧水消毒液生成机的臭氧浓度，是牙科治疗台管道内臭氧水的臭氧浓度保持适宜（用靛蓝二磺酸钠分光光度法GB/T15437-1995测定）。1.4.本消毒方法实施后牙科治疗台水系统水样的检测：1.4.1.口腔治疗台水系统水样的临床检测：因本研究采用臭氧水直接连通各牙科治疗台水系统管道（原储水罐已取消），故消毒后的细菌学检测只对手机连接管和水枪的出水样本进行，对于此二部位样本的采集和检测方法同安装臭氧消毒之前。1.4.2.适宜浓度臭氧水对细胞生长影响的检测：细胞（Hep-2）长成单层96孔板，同时设正常细胞对照，细胞与臭氧水混合2h、4h、8h、16h、24h，按细胞培养方法培养后，在显微镜下观察细胞形态。使用统计学方法：采用方差分析、F检验和q检验。2.结果2.1牙科治疗台水系统污染情况的检测结果：2.1.1.治疗台水系统各部位细菌污染检测结果：储水罐平均菌丛含量2.46±0.392CFU/ml（最高值3.47CFU/ml，最低值1.58CFU/ml）；手机连接管菌丛含量3.66±0.48CFU/ml（最高值4.47CFU/ml，最低值2.78CFU/ml）；水枪菌丛含量2.61±0.55CFU/ml（最高值3.36CFU/ml，最低值1.91CFU/ml）。经方差分析各牙科治疗台间无显著性差异，反应出各治疗台均存在污染严重的情况；q检验储水罐与手机连接管之间呈显著性差异，可以认为储水罐的污染水经过手机连接管后又混入了回吸的二次污染，加重手机连接管内水的污染程度。见表1。2.2.2.牙科治疗台水系统污染的细菌种类检测结果：以上污染所检出的细菌种类包括致病菌和非致病菌，致病菌包括：支气管败血鲍特氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、假单胞菌；非致病菌包括：皮氏伯克氏菌、霉菌/酵母菌、非解糖鞘氨醇单细胞。2.2.3.生物膜的观察结果：对牙科治疗台水系统生物膜的显微镜下观察显示，储水罐中生物膜生物相较为复杂，包含细菌、真菌、藻类和其他杂质；手机连接管中生物膜的生物相比较单一，主要由细菌、有机物碎片（破碎的血细胞样物）等组成。3.臭氧消毒效果的检测结果3.1.对牙科治疗台临床水样的检测结果：对以上选择的6台牙科治疗台，通入适宜浓度的臭氧水后，随机采集水样，于10min、20min、1h、4h、24h、48h、3d、7d、10d、20d对水样进行抽样检测，细菌含量均