第九章生物技术药物

1第九章生物技术药物制剂2本章内容：第一节概述第二节蛋白质类药物制剂的处方和工艺第三节蛋白质类药物新型给药系统第四节蛋白质类药物制剂的评价方法3第一节概述生物技术的基本概念生物技术药物的研究概况生物技术药物的特点蛋白质类药物的结构特点与理化性质4一生物技术的基本概念生物技术或称生物工程（biotechnology),是指应用生物体（包括微生物，动物细胞，植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。现代生物技术主要包括基因工程，细胞工程与酶工程。此外还有发酵工程（微生物工程）与生化工程。生物技术药物制剂是指采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产的药品。采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物也称为生物技术药物。5二、生物技术药物的研究概况生物技术药物产品，目前国内外已批准上市的约100多种，正在研究的数百种之多，这些药物均属肽类与蛋白质类药物。6表已上市的部分常见生物技术药物药品名缩写作用与用途1.重组细胞因子药物α干扰素IFNα白血病、肝炎、癌症、ABs等γ干扰素IFNγ慢性肉芽肿、过敏性皮炎等β干扰素IFNβ多发性硬化症粒细胞-集落剌激因子G-CSF骨髓移植、粒细胞减少、AIDs、再障等粒细胞巨噬细胞-集落剌激因子GM-CSF骨髓移植、粒细胞减少、AIDs、再障等人促红细胞生成素EPO各种贫血症白细胞介素2IL-2癌症、免疫缺陷、免疫佐剂白细胞介素11IL-11放化疗所致血小板减少表皮生长因子EGF外用治疗烧伤与溃殇碱性成纤维细胞生长因子bFGF外用治疗烧伤、外周神经炎2.重组激素类药物人胰岛素Insulin治疗糖尿病人生长激素rhGH促进身体长高3.治疗性抗体小鼠抗T细胞单抗OKT3治疗急性肝移植后的排斥反应抗血小板凝聚单抗预防血管成型术中的血液凝结小鼠抗CIh单抗CD3Mab治疗肾移植后的排斥反应4.其他类组织纤溶酶原激活素t-PA治疗急性心肌梗死乙肝病毒疫苗HBV疫苗预防乙型肝炎肿瘤坏死因子受体TNF受体治疗顽固性类风湿关节炎7表已上市的部分常见生物技术药物药品名缩写作用与用途1.重组细胞因子药物α干扰素IFNα白血病、肝炎、癌症、ABs等γ干扰素IFNγ慢性肉芽肿、过敏性皮炎等β干扰素IFNβ多发性硬化症粒细胞-集落剌激因子G-CSF骨髓移植、粒细胞减少、AIDs、再障等粒细胞巨噬细胞-集落剌激因子GM-CSF骨髓移植、粒细胞减少、AIDs、再障等人促红细胞生成素EPO各种贫血症白细胞介素2IL-2癌症、免疫缺陷、免疫佐剂白细胞介素11IL-11放化疗所致血小板减少表皮生长因子EGF外用治疗烧伤与溃殇碱性成纤维细胞生长因子bFGF外用治疗烧伤、外周神经炎2.重组激素类药物人胰岛素Insulin治疗糖尿病人生长激素rhGH促进身体长高3.治疗性抗体小鼠抗T细胞单抗OKT3治疗急性肝移植后的排斥反应抗血小板凝聚单抗预防血管成型术中的血液凝结小鼠抗CIh单抗CD3Mab治疗肾移植后的排斥反应4.其他类组织纤溶酶原激活素t-PA治疗急性心肌梗死乙肝病毒疫苗HBV疫苗预防乙型肝炎肿瘤坏死因子受体TNF受体治疗顽固性类风湿关节炎药品名缩写作用与用途1.重组细胞因子药物α干扰素IFNα白血病、肝炎、癌症、ABs等γ干扰素IFNγ慢性肉芽肿、过敏性皮炎等β干扰素IFNβ多发性硬化症粒细胞-集落剌激因子G-CSF骨髓移植、粒细胞减少、AIDs、再障等粒细胞巨噬细胞-集落剌激因子GM-CSF骨髓移植、粒细胞减少、AIDs、再障等人促红细胞生成素EPO各种贫血症白细胞介素2IL-2癌症、免疫缺陷、免疫佐剂白细胞介素11IL-11放化疗所致血小板减少表皮生长因子EGF外用治疗烧伤与溃殇碱性成纤维细胞生长因子bFGF外用治疗烧伤、外周神经炎2.重组激素类药物人胰岛素Insulin治疗糖尿病人生长激素rhGH促进身体长高3.治疗性抗体小鼠抗T细胞单抗OKT3治疗急性肝移植后的排斥反应抗血小板凝聚单抗预防血管成型术中的血液凝结小鼠抗CIh单抗CD3Mab治疗肾移植后的排斥反应4.其他类组织纤溶酶原激活素t-PA治疗急性心肌梗死乙肝病毒疫苗HBV疫苗预防乙型肝炎肿瘤坏死因子受体TNF受体治疗顽固性类风湿关节炎89三、生物技术药物的特点1．蛋白质或多肽类药物大多为内源性物质，临床使用剂量小，药理活性高，副作用小，很少有过敏反应；2．蛋白质或多肽类药物稳定性差，在酸碱环境或体内酶存在下极易失活；3．蛋白质或多肽类药物分子量大，还时常以多聚体形式存在，很难透过胃肠道粘膜的上皮细胞层，故吸收很少，不能口服给药，一般只有注射给药一种途径；4．蛋白质或多肽类药物体内生物半衰期较短，从血中消除较快，因此在体内的作用时间较短，往往不能充分发挥其作用。10四蛋白质类药物的结构特点与理化性质（一）蛋白质的结构特点1蛋白质的组成蛋白质是由许多氨基酸按一定排列顺序通过肽键相连而成的多肽链。多肽指10个以上氨基酸组成的肽。蛋白质结构中的化学键包括共价键与非共价键。肽键二硫键为共价键。非共价键包括氢键、疏水键、离子键、范德华力、和配位键。112蛋白质结构蛋白质结构可分为一、二、三、四级结构一级结构为初级结构，指蛋白质多肽链中的氨基酸排列顺序，包括肽链数目和二硫键位置。二、三、四级结构为高级结构或空间结构，高级结构和二硫键与蛋白质的生物活性有重要关系。12•牛胰岛素的一级结构13α螺旋与β折叠14蛋白质高级结构示意图15血红蛋白的四级结构163蛋白质分子的空间结构与生物活性蛋白质分子只有在其立体结构呈特定的构象（conformation)时才有生物活性，形成稳定的蛋白质分子构象的作用力有氢键、疏水作用力（hydrophobicforce)、离子键、范德华力、二硫键与配位键。除二硫键为共价键外，其余都是非共价键，维持蛋白质构象是弱作用力。17（二）、蛋白质的理化性质1蛋白质的一般理化性质（1）旋光性蛋白质分子总体旋光性由构成氨基酸各个旋光度的总和决定，通常是右旋，它由螺旋结构引起。蛋白质变性，螺旋结构松开，则其左旋性增大。18（2）紫外吸收大部分蛋白质均含有带苯丙氨酸，酪氨酸与色氨酸，苯核在紫外280nm有最大吸收。测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法19（3）蛋白质两性本质与电学性质蛋白质除了肽链N-末端有自由的氨基和C-末端有自由的羧基外，在氨基酸的侧链上还有很多解离基团，这些解离基团在一定pH条件下都能发生解离而带电。因此蛋白质是两性电解质，在不同pH条件下蛋白质会成为阳离子，阴离子或二性离子。202蛋白质不稳定的原因（1）共价键破坏引起不稳定性a.蛋白质水解蛋白质可被酸，碱和蛋白酶催化水解，使蛋白质分子断裂，分子量逐步变小，成为分子量大小不等的肽段和氨基酸。水解分完全水解与不完全水解。b.蛋白质的氧化蛋白质中具有芳香侧链的氨基酸可以在一些氧化剂作用下氧化。常用氧化剂有分子氧、过氧化氢、过甲酸、氧自由基等。21c.外消旋作用某些旋光性物质在化学反应过程中，由于不对称碳原子上的基团在空间位置上发生转移，使D-或L-型化合物转变为D-型和L-型各50%的混合物，彼此旋光值抵消，失去旋光性，这种现象称为外消旋作用。当蛋白质用碱水解时往往会使某些氨基酸产生消旋作用。d.二硫键断裂及其交换二硫键把同一肽链或不同肽链（肽链间）的不同部分连接起来，对稳定蛋白质的构象起重要作用。蛋白质分子中二硫键断裂接着重排能够改变蛋白质的三级结构，因此影响其生物活性。22（2）非共价键引起的不稳定性引起蛋白质不可逆失活作用的三种主要类型聚集与沉淀、表面吸附和蛋白质变性，这些都是由于与空间构象有关的非共价键引起。非共价的静电力，氢键，疏水的相互作用以及蛋白质的水化，可以因温度和pH值而发生改变。23a.蛋白质的聚集与沉淀蛋白质聚集(凝集)是蛋白质分子结合的微观过程。蛋白质沉淀指可见蛋白质颗粒的生成。不可逆的聚集往往是由于蛋白质伸展所致。蛋白质溶液振摇可以导致聚集与沉淀，这是由于空气氧化，界面变性，吸附于容器或机械应力所致。24b,蛋白质的吸附蛋白质和多肽吸附于容器、滤器或输液系统材料的表面，当蛋白质溶液浓度较低时，由于吸附药物损失相对就较高。c,蛋白质的变性蛋白质在受到一些物理因素或化学试剂影响会导致蛋白质性质发生变化，如发生溶解度的降低、旋光值改变、光吸收系数的增大、粘度改变、聚集，沉淀等,但蛋白质的一级结构即肽键没有被破坏,这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。25引起蛋白质变性的因素①温度的影响：蛋白质在50~60°C的溶液中，经过一定时间，往往发生变性。有些蛋白质热变性是可逆的，有些是不可逆的。不可逆热变性往往发生沉淀和聚集现象。一般来说，热变性仅涉及非共价键的变化。26引起蛋白质变性的因素②pH对蛋白质构象的影响：大多数蛋白质，仅在pH4-10的范围内是稳定的，超过这个范围，就发生变性，也有些蛋白质只有当pH2时，才发生变性。③有机溶剂的影响：大多数蛋白质水溶液在加入一定量的有机溶剂后蛋白质就开始析出沉淀。脱水27引起蛋白质变性的因素④盐的影响：盐对蛋白质构象稳定性的影响是很复杂。盐溶和盐析。⑤表面活性剂对蛋白质构象的影响：长链的脂肪酸（如月桂酸）或相应的表面活性剂（如十二烷基硫酸钠）很容易与蛋白质反应，常常引起蛋白质解离，在很低的浓度下，就能引起蛋白质变化。28（三）蛋白质类药物的评价方法（1）液相色谱法液相色谱法是评价蛋白质的纯度与稳定性有力的工具。在蛋白质分析中通常采用反相高压液相色谱法RP-HPLC、离子交换色谱IEC与分子排阻色谱SEC。反相色谱是以非极性固定相与含水的极性流动相为基础的分析方法。应用反相HPLC，由于有机溶剂，疏水的相互作用及分离时所用低pH值，会使蛋白质变性。然而该方法对几种蛋白质特别有用，并被广泛地用于胰岛素制剂的质量分析。29图1牛胰腺提取的胰岛素图2单组份胰岛素对照品图3猪胰腺提取的胰岛素从色谱图上看，牛胰岛素比猪胰岛素的洗脱时间稍短些。牛和猪胰腺提取的胰岛素在0～5min之间有一串复杂的吸收峰，这是因为提取出的胰岛素含有一定的杂质所致。30（2）、光谱法通过对蛋白质吸收、辐射、散射光的定量分析可以提供有价值的信息，了解蛋白质的量、构象和聚集倾向。用于评价蛋白质药物的光谱方法有紫外可见吸收光谱UV、旋光色散ORD、圆二色谱CD、荧光、红外IR和拉曼Raman光谱。紫外吸收常用于测定溶液中蛋白质的浓度。光散射可用测定制剂中蛋白质的聚集数量。31（3）、电泳电泳技术是根据在电场的作用下，蛋白质在载体凝胶上产生特征性迁移，迁移率是所带净电荷和它的大小函数，以此来分离混合蛋白质。在蛋白质的分析中广泛使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳（SDS-PAGE），等电点聚焦(isoclectricfocusing，IEF)和毛细管电泳（EC）法。SDS-PAGE电泳用于测定蛋白质亚单位组成和分子量。EC优点是：分辨率高、灵敏度高、分析时间短、易于自动化。32（4）、生物活性测定与免疫测定生理活性检测是利用体内模型或体外组织或细胞对活性蛋白质多肽的特异生物学反应，通过剂量(或浓度)效应曲线进行定量（绝对量或比活性单位）。用理化方法代替生物活性测定时，需建立两种方法之间的相关性。免疫测定优点是可用于定量化学分析不能检测的情况。33ELISA34第二节蛋白质类药物制剂的处方和工艺一、蛋白质类药物的一般处方组成目前临床上应用的蛋白质类药物注射剂，一为溶液型注射剂，另一种是冻干粉注射剂。溶液型使用方便，但需在低温（2～8℃）下保存。冷冻干燥型比较稳定，但工艺较为复杂。35举例:α-2b干扰素（INFα-2b，商品名IntronA）剂型：注射用冻干粉针处方组成：每瓶含蛋白质5mg,Na2HPO49mg,NaH2PO42.25mg,NaCl43mg，聚山梨酯－801.0mg。贮存条件：临用时用注射用水配制，2～8℃可保存30