第二十一章氨基酸类药物

第二十一章氨基酸类药物一、氨基酸及其衍生物在医药中的应用氨基酸是构成蛋白质的基本组成单位，蛋白质的生物功能与构成蛋白质的氨基酸种类、数量、排列顺序及由其形成的空间构象有密切的关系。氨基酸通过体内转化而维持其动态平衡，若其动态平衡失调，则机体代谢紊乱，甚至引起病变。必需氨基酸：人及哺乳动物自身不能合成，需由食物供应。氨基酸具有丰富的营养价值，能治疗多种疾病，氨基酸及其衍生物能够治疗消化道疾病、肝病、脑及神经系统疾病、肿瘤和其它与氨基酸相关联的疾病。二、氨基酸类药物的生产方法1、目前全世界天然氨基酸的年总产量在百万吨左右，其中产量较大者有谷氨酸、蛋氨酸及赖氨酸，其次为天门冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它们主要用于医药、食品、饲料及化工行业中。2、氨基酸的生产方法有天然蛋白质水解法、发酵法、酶转化法及化学合成法等四种。3、氨基酸及其衍生物类药物已有百种之多，但主要是以20种氨基酸为原料经酯化、酰化、取代及成盐等化学方法或酶转化法生产。（一）水解法1、基本原理与过程以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法称为水解法。目前用水解法生产的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸及L-丝氨酸等。水解法生产氨基酸的主要过程为水解、分离和结晶精制三个步骤。（1）蛋白质水解方法目前蛋白质水解分为酸水解法、碱水解法及酶水解法三种。①酸水解法：蛋白质原料用6～10mol／L盐酸或8mol／L硫酸于110～120℃（回流煮沸）水解12～24h，除酸后即得多种氨基酸混合物。此法优点是水解迅速而彻底，产物全部为L-型氨基酸，无消旋作用。缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸及酪氨酸部分被破坏，且产生大量废酸污染环境。工业上较普遍采用。②碱水解法：蛋白质原料经6mol／L氢氧化钠或4mol／L氢氧化钡于100℃水解6h即得多种氨基酸混合物。该法水解迅速而彻底，且色氨酸不被破坏，但含羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用。工业上多不采用。③酶水解法：蛋白质原料在一定pH和温度条件下经蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的过程称为酶水解法。此法优点为反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸不破坏，无消旋作用。缺点是水解不彻底，产物中除氨基酸外，尚含较多肽类。工业上很少用该法生产氨基酸而主要用于生产水解蛋白及蛋白胨。（2）氨基酸分离方法氨基酸分离方法较多，通常有溶解度法、等电点沉淀法、特殊试剂沉淀法、吸附法及离子交换法等。①溶解度法：是依据不同氨基酸在水中或其它溶剂中的溶解度差异而进行分离的方法。胱氨酸和酪氨酸均难溶于水，但在热水中酪氨酸溶解度较大，而胱氨酸溶解度变化不大，故可将混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分开。②特殊试剂沉淀法：系采用某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物的分离方法。③吸附法：是利用吸附剂对不同氨基酸吸附力的差异进行分离的方法。如颗粒活性炭对苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附力大于对其它非芳香族氨基酸的吸附力，故可从氨基酸混合液中将上述氨基酸分离出来。④离子交换法：是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异进行分离的方法。氨基酸为两性电解质，在特定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，故同一种离子交换剂对不同氨基酸的吸附力不同。（3）氨基酸的精制方法分离出的特定氨基酸中常含有少量其它杂质，需进行精制，常用的有结晶和重结晶技术，也可采用溶解度法或结晶与溶解度法相结合的技术。丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度较小，且pI为6.0，故丙氨酸可在pH6.0时，用50％冷乙醇结晶或重结晶加以精制。溶解度与结晶技术相结合的方法精制氨基酸。如在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若将含少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍体积（w／v）的热水中，调pH4.0左右，经脱色过滤可除去大部分酪氨酸；滤液浓缩至原体积的1／3，加2倍体积（v／v）的95％乙醇，4℃放置，滤取结晶，用95%乙醇洗涤，烘干即得苯丙氨酸精品。2、用水解法生产氨基酸的品种及工艺绝大多数氨基酸均可采用酸水解法生产，但目前由于发酵方法及酶工程技术的迅速发展，仅有几种氨基酸仍采用酸水解法生产。现胱氨酸与亮氨酸生产为例。L-胱氨酸（L-Cystine，L-Cys2）的制备：（1）L-胱氨酸的结构与性质：以毛、发及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由两分子半胱氨酸脱氢氧化而成，结构为：L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶体，分解点258~261℃，pI为5.05，〔α〕25D为-232°。在25℃水中溶解度为0.011，在75℃水中为0.052。溶于无机酸及无机碱，在热碱液中可被分解。不溶于乙醇、乙醚及丙酮。可被还原为L-半胱氨酸。（2）工艺路线（3）工艺过程①水解：在1-1.5h内升温至110～117℃水解7h（自100℃时计）后出料,玻璃布过滤,收集滤液。②中和：用30%工业碱调至pH4.8，静置36h，涤纶布滤取沉淀，离心甩干得L-胱氨酸粗品Ⅰ。③粗制：加入10mol/L盐酸、水，升温至65～70℃，搅拌0.5小时，加活性炭16kg/0.2t粗品Ⅰ，于80～90℃保温0.5h，滤除活性炭。用30%工业碱调滤液至pH4.8，静置结晶，吸出上清液后，底部沉淀经离心甩干得胱氨酸粗品（Ⅱ）。④精制、中和：粗品Ⅱ加入1mol/LHCl，升温至70℃，加活性炭1.5～2.5kg/50kg粗品Ⅱ，85℃搅拌0.5h，过滤，加1.5倍体积蒸馏水，升温至75～80℃，搅拌下用12％氨水（化学纯）中和至pH3.5～4.0，析出结晶，滤取胱氨酸结晶，蒸馏水洗至无氯离子，真空干燥得L-胱氨酸成品。⑤检验与含量测定：应为六角形或六角柱形白色结晶，含量在98.5％以上，干燥失重小于0.5％，炽灼残渣小于0.2％，氯化物小于0.15％，铁盐小于0.001％，重金属小于20ppm。⑥作用与用途：L-胱氨酸具有增强造血机能、升高白细胞、促进皮肤损伤的修复及抗辐射作用。临床上用于治疗辐射损伤、重金属中毒、慢性肝炎、牛皮癣及病后或产后继发性脱发。(二)发酵法1、基本原理与过程工业上，发酵实质上是利用微生物细胞中酶的作用，将培养基中有机物转化为细胞或其它有机物的过程。利用微生物代谢中间产物加入NH3或HNO3，合成氨基酸。★初生氨基酸：微生物通过固氮作用、硝酸还原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相应的氨基酸，或微生物通过转氨酶作用，将一种氨基酸的氨基转移到另一种酮酸上，生成的新氨基酸也称为初生氨基酸。★次生氨基酸：在微生物作用下，以初生氨基酸为前体转化成的其它氨基酸。大多数氨基酸均可通过以初生氨基酸为原料的微生物转化作用而产生。2、发酵法生产的氨基酸品种及工艺微生物利用碳源、氮源及盐类几乎可合成所有氨基酸。目前绝大部分氨基酸皆可通过发酵法生产，其缺点是产物浓度低，设备投资大，工艺管理要求严格，生产周期长，成本高。本文仅以L-异亮氨酸直接发酵法为例，说明发酵法的基本过程。L-异亮氨酸（L-Isoleucine，L-Ile）的制备（1）L-异亮氨酸的结构与性质：L-Ile存在子所有蛋白质中，为人体必需氨基酸之一，分子式为C6H13NO2，分子量为131.17，结构式为：L-Ile在乙醇中形成菱形叶片状或片状晶体，分解点为285～286℃，L-Ile溶于热醋酸，在20℃乙醇中溶解度为0.072，在25℃水中为4.12，在75℃水中为6.08，不溶于乙醚。（2）工艺路线（3）工艺过程①菌种培养种子培养基组成（%）为：葡萄糖2尿素0.3玉米浆2.5豆饼水解液0.1（以干豆饼计）pH6.5。二级种子培养基另加菜籽油0.4，其余同一级种子培养基。一级种子培养：1000ml三解瓶中培养基装量为200ml，接种一环牛肉膏斜面AS1.998菌种，摇床30℃培养（冲程7cm，频率105次／min）16h。二级种子培养：接种量3.5％，培养8h，如此逐级放大培养得足够量菌种。②灭菌、发酵发酵培养液组成（%）为:硫酸铵4.5豆饼水解液0.4，玉米浆2.0碳酸钙4.5pH7.2，淀粉水解还原糖初糖浓度11.5。在5m3发酵罐中添加3吨发酵培养液，加热至118～120℃，维持在1.1×105Pa压力，灭菌30min，立即通冰盐水冷却至25℃。接入1％菌种（v／v），维持180转／min的搅拌速度，升温至30～31℃，以0.2L／（min·L）通气量发酵60h，在24～50h之间不断补加尿素至0.6，氨水至0.27。③除菌体、酸化发酵结束后，发酵液加热至100℃并维持10min，冷却过滤，滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5，过滤除沉淀。④离子交换、吸附分离上述滤液每分钟以树脂量1.5％的流速进H十-型732离子交换柱（Φ40×100cm），以100L去离子水洗柱，再以60℃、0.5mol／L氨水按3L/min的流速进行洗脱，分部收集洗脱液。⑤浓缩赶氨合并pH3～12的洗脱液，70～80℃减压蒸馏、浓缩至粘稠状，加去离子水至原体积的1／4，再浓缩至粘稠状。如此重复三次。⑥脱色、浓缩、中和上述浓缩物加去离子水至原体积的1／4，搅拌均匀，加2mol／L盐酸调pH3.5，加上1％（w／v）活性炭，70℃搅拌脱色1h。滤除活性炭，滤液减压浓缩至适当体积，用2mol／L氨水调pH6.0，5℃沉淀过夜,过滤抽干，105℃烘干得：L-异亮氨酸半成品。⑦精制、烘干每10kgL-异亮氨酸半成品加8L浓盐酸和20L去离子水，加热至80℃，搅拌溶解，加10kg氯化钠至饱和，加工业碱液调pH10.5，过滤，滤液用碱调pH1.5，5℃放置过夜。滤取沉淀，用80L，去离子水加热至80℃搅拌溶解，加适量氯化钠和1%（w／v）活性炭，70℃搅拌脱色lh过滤，滤液减压浓缩至适当浓度，用氨水调pH6.0，5℃放置结晶过夜。次日过滤收集结晶，抽干，于105℃烘房中烘干得L-异亮氨酸成品。（4）检验应为菱形叶片状或片状晶体，含量应为98.5％～101.5％，干燥失重不超过0.3％，炽灼残渣不大于含量测定与L-亮氨酸的规定相同。氯化物低于0.05％，硫酸盐低于0.03％，铁盐低于0.003％,重金属低于0.0015％，砷盐低于1.5ppm。（5）作用与用途L-Ile为必需氨基酸，是复方氨基酸输液的重要成份之一。