第二十章胆固醇逆向转运研究方法

第二十章胆固醇逆向转运研究方法第一节胆固醇及胆固醇酯测定一、高效液相色谱分析细胞内胆固醇及胆固醇酯(一)胆固醇标准品配制称1.5g标准胆固醇溶于少许乙醇中，逐渐升温到2o°C，并把乙醇体积补满到150ml,标准胆固醇的工作浓度分别为0.129(50)、0.258(100)、0.516(200)、1.032(400)、2.064(800)。单位mmol/L(mg/L)。4℃下储存备用。(二)细胞内胆固醇及胆固醇酯的提取将每10ml细胞收集人带盖的10ml塑料管中，1500r/min、4℃离心15min、去上清，用1ml0.9%Nacl溶液重新稀释细胞，冰浴中超声破碎细胞。工作条件为600W,工作时间为4s，间隙时间为8s，定时次数为6次。用Lowrry法测定蛋白含量。在细胞溶解产物中加人等体积新鲜配制的15%醇溶性KOH(一20℃)，振荡至细胞溶解产物清亮，加人6%的三氯乙酸去蛋白，再加人等体积的正己烷：异丙醇溶液(4:1,V：V)，将混合物涡旋5min，然后1500r/min、15℃离心5min，收集上层有机相。(三)高效液相色谱(highperforma·celiquidchromatogram,HPLC)分析采用Waters991型色谱系统，其中包括510泵、U-6K进样器、991型光电二极管矩阵监测器、TCM色谱恒温盒，采用Waters公司生产的Gen-PAKFAX柱，以异丙醇：正庚烷：乙腈(35:12:53,V：V：V)为流动相，进行非梯度洗脱，流速1ml/min，柱温保持4℃(加冰块)，紫外检测时间12min，检测波长为226nm.Gen-PakFAX柱子在使用前用去离子水洗10min(流速0.5ml/min)以除去柱中的醇类物质。(四)细胞内游离胆固醇及胆固醇酯定量1、游离胆固醇的定量胆固醇以峰面积定量，蛋白质用BCA法定量。参照PierceChemical公司的BCA试剂盒说明书的方法进行。按A：B=50：1的比例配置显色工作液。以牛血清蛋白(BSA)为标准，并以标准蛋白的吸光值作标准曲线。取11支洁净的试管，分别标好1～11,1号为空白管，2～6号为标准蛋白管，7～11号为待测蛋白管。空白管中加入1mlAB显色工作液，1ml蒸馏水，2～6号管分别按顺序加人浓度为31.25、62.5、125、250、500µg/ml的标准蛋白0.1ml，分别加入AB显色工作液0.9ml，蒸馏水1ml，7、8、9、10、11号管为待测样品，各测定管分别加入待测蛋白0.1ml,AB显色工作液0.9ml，蒸馏水1ml，混匀，37℃水浴30min，室温放置，以蒸馏水为空白管调零，在波长562nm下，测各管的OD值。2、胆固醇酯的定量以胆固醇酯酶(cholesterolesterase,CEase)水解，以HPLC测定总胆固醇(totalcholesterol,TC)，以总胆固醇减去游离胆固醇(freecholesterol,FC)代表胆固醇酯(cholesterylester,CE)的量，以mg/g细胞蛋白为单位。3、胆固醇峰鉴定(1)保留时间：通过比较标准胆固醇出峰时间与样品中各峰的出峰时间，与胆固醇标准的保留时间接近的峰即可能是胆固醇峰。(2)外标法：首先进一针样品，记录其色谱图，接着用相同样品量与相当量胆固醇标准混合进针一次，记录其色谱图，样品中加标准胆固醇液色谱图中明显升高的峰就可能是胆固醇峰。(3)内标法：待细胞处理结束后，弃培养基，PBS洗3次，加人细胞裂解液500µl，反复冻融3次裂解细胞，BCA法定量蛋白后，7.2%三氯乙酸沉淀蛋白，800g离心10min，取上清进行胆固醇检测，以豆甾醇为内标。取100µl上清液加入8.9mol/L，醇溶性氢氧化钾溶液400µl，水解30min后使胆固醇酯为胆固醇。各待测样品分别与内标混匀，用正己烷和无水乙醇抽提后，1.5mol/L三氧化铬氧化衍生30min后，真空干燥，200µl乙腈：异丙醇(80：20)溶解样品，进样进行高效液相色谱分析，采用C18柱，柱温4℃，流速1ml/min，检测波长250nm，胆固醇以峰面积定量，内标校准，计算值以蛋白含量校正（µg/g蛋白)。(4)光谱分析法：把样品中各峰的光谱图形与标准胆固醇的光谱图形进行比较，与标准胆固醇光谱图形相同的就是样品中胆固醇峰。(5)L-B(Liberman-Burchard)反应法：收集样品中各峰，并浓缩，然后用L-B法直接显色。具体操作如下：取10ml试管一支，往其中加人0.2ml样品、0.5ml冰醋酸和5.0ml乙酸酐，于振荡器上剧烈振荡混匀，5min后1500g离心5min，吸取上清液4.0ml于25℃水浴5min，最后加0.2ml浓硫酸显色，在630nm处比色，测定光密度值。注意以上几种方法常联合起来进行分析。(五)高效液相色谱测定细胞内胆固醇及胆固醇酯的特点1、测定泡沫细胞内胆固醇和胆固醇酯的重要性泡沫细胞(foamcell)的形成是动脉粥样硬化形成的始动步骤，研究泡沫化过程是探索动脉粥样硬化防治的一条重要途径。泡沫细胞的形成是由于细胞内胆固醇酯的积累而引起的，而泡沫细胞的细胞学定义为细胞内胆固醇酯占总胆固醇的50%以上，因而，研究泡沫化过程的一个重要方面就是要求准确地测定胆固醇与总胆固醇的比值。通过测定U937细胞内胆固醇酯与总胆固醇，能找到一种判断泡沫细胞与非泡沫细胞而较为精确实用的方法。2、高效液相色谱测定的特点高效液相色谱具有适于微量分析的特点，近年来国内外很多学者基本上不采用化学显色法测定胆固醇(胆固醇酯)，而采用高效液相色谱的方法，如董军等采用高效液相色谱法分析人胎肝细胞培养基中7-酮基胆固醇。采用高效液相色谱测血清中胆固醇及胞内胆固醇(胆固醇酯)测定要求较高。最近，国外学者采用HPLC分析胞内胆固醇，但在细胞内有些胆固醇酯种类尚未搞清楚的情况下，没有标准品，因而，尚不能单独依靠HPLC法来对胆固醇酯进行精确定量。因此在对U937单核细胞株泡沫化前后胞内胆固醇(酯)分析时，采用适于用核酸分离的Gen-PAX分离柱，能较为直观地看出ox-LDL处理48h的U937细胞内胆固醇酯含量明显高于对照组细胞内的胆固醇酯的含量，并且其胆固醇酯与总胆固醇的比值大于50%，符合泡沫细胞的定义(这种处理的U937细胞以通过细胞形态鉴定，油红O染色可见胞浆有许多细小的红染脂质颗粒，电镜下胞浆中可见大小不一的融合脂滴)，故可以认为处理组细胞为泡沫细胞。采用异硫氰酸苯酯衍生法和苯甲酰氯衍生法虽能对胆固醇较好定量，但对胆固醇酯也同样不好单独定量。采用高效液相色谱虽具有很多优点，但在操作时仍有很多值得注意的地方。其中之一是色谱柱的选择，一般来说，三种常规柱子(分子筛、反相、离子交换)中以反相柱分辨率最高，但由于胆固醇(酯)本身疏水性较强，如采用C18填料反相柱，即使采用非极性较强的洗脱剂(如正庚烷：异丙醇：乙腈)，胆固醇根本就无法从柱子上洗下来，如再采用非极性更高的洗脱剂，则黏度太大，压力太高，造成分辨率低。有些非极性试剂即使可以把胆固醇(酯)洗下来，但表现出是一种非特异性洗脱，故在HPLC分析胆固醇(酯)时采用疏水性较弱的柱子，Waters公司生产的Gen-PAX柱，是在以硅胶作填料的基础上，在硅醇基上接上多聚碱基的阴离子材料，这种型号的柱子填料的碱基既具有部分疏水性，又具有部分阴离子交换的性质。另外，我们采用真空冷冻干燥的浓缩方法，进一步提高了该方法的灵敏度。通过图20-1中“A”图与“B”图的比较，可见处理组细胞与非处理组细胞之间不但胆固醇酯与总胆固醇之比存在差异，其胆固醇酯的种类及不同胆固醇酯含量的多少都有可能存在差别。即有些种类的胆固醇酯可能在非泡沫细胞中原来没有，而是在泡沫化过程中形成的；有些胆固醇酯种类也可能在泡沫化过程中丢失；有些则在泡沫化之前含量很少。而在泡沫化过程中合成急剧增加；有些则在泡沫化前后无多大变化；有些则可能在泡沫化之前含量较多，而在泡沫化过程中含量较少。如能搞清楚以上所述这些胆固醇酯的变化，无疑有利于加深我们对泡沫化过程的了解。二、细胞内胆固醇测定其他方法(一)化学法直接皂化-硫酸铁铵比色法快速测定样品中的胆固醇：准确称取充分混匀的样品约0.20g于50ml具塞比色管中，加入2.0mol/L的K0H-乙醇溶液5.0ml，振荡混匀，置65°C水浴中皂化30min(每隔5min振摇1次)后取出，经流水冷却，加入饱和氯化钠溶液2.0ml后再加入石油醚20.0ml，旋涡混匀后离心分离，吸取上清液1.0ml于25ml具塞比色管中，再于65°C水浴中通氮气吹干，加入4.0ml冰醋酸溶解残渣、加入2.0ml硫酸铁铵显色剂，混匀，10min后在分光光度计560nm波长处比色测定。按测得的吸光度在标准曲线上査得相应的胆固醇含量。硫酸铁铵储备液：溶解4.463g硫酸铁铵于100ml85%磷酸中。硫酸铁铵显色剂；10ml硫酸铁铵储备液用浓硫酸稀释至100ml，将此液放置在硅胶干燥器中备用。胆固醇标准液(1.0mg/m1)：准确称取胆固醇l00mg，溶于冰醋酸中，并稀释至100ml。胆固醇标准使用液(0.10mg/ml)取胆固醇标准储备液10.0ml，用乙酸稀释至100ml.(二)生物法1、酶法(1)原理：以胆固醇酯酶(CEH)水解血清中的胆固醇酯(CE)，同时以胆固醇氧化酶(CHOD)将胆固醇(chol)氧化成胆甾烯酮和过氧化氢(H2O2)的方法。终点产物的测定有△4胆甾烯酮分光光度法及测H2O2的方法，其中应用最广的是用Trinder显色反应系统，试剂含过氧化酶(POD)、4-氨基安替比林(4-AAP)和酚，三者合称PAP,目前，国内胆固醇试剂盒都用这种方法。CEHCE十H2O—→chol十脂肪酸Chol十O2——→△4胆甾烯酮十H2O2PDOH2O2十4AAP十酚—→醌亚胺染料十4H2O红色醌亚胺的最大吸收波长为500nm，由于吸收峰平坦，波长470～550nm均可用，为了减少胆红素与血红蛋白的干扰，可用520nm比色。(2)试剂及纯度CEH(EC3.1.1.13)：来源于假单胞菌属等微生物，杂酶中葡萄糖氧化酶与尿酸酶应小于0.01%，不含过氧化氢酶，比活约100U/mg酶蛋白(25°C，chol油酸酯为底物)。CHAD(EC1.1.3.6)：来源于诺卡菌等微生物，杂酶中葡萄糖氧化酶与尿酸酶应小于0.01%，不含过氧化氢酶，比活约45U/mg酶蛋白(37°C，chol为底物)。POD(EC1.11.1.9)：来源于辣根，纯度值(reinheitszahl比值，A403nm/A275nm）约为3.0，比活1000U/mg酶蛋白(25℃，ABTS单位)。表面活性剂TritonX-100:不含过氧化酶，不会使配好的酶试剂增加空白读数。磷酸盐、胆酸钠、4-AAP与酚均为分析试剂。试剂配制(终点法测定用)。磷酸盐缓冲液，pH7.7,0.3mol/L，CEH(假单胞菌)≥800U/L，CH0D(诺卡菌)≥400U/L，POD(辣根≥1000U/L，胆酸钠3mmol/L，4AAP0.5mmol/L，酚3.5mmol/L..TritonX-1003g/L.缓冲液用于复溶其他试剂，酶与显色剂可以分装为两管，其剂型可以为水溶液、冻干晶或干粉。磷酸盐缓冲液可用Tris缓冲液替代，后者的浓度为l00mmol/L,pH7.7，为了提高灵敏度，酚可以用其衍生物或其他色原代替。(3)胆固醇参考标准物质(standardreferencematerial,SRM)：TC测定要求做到标准化，与国际标准取得一致，必须有准确可靠的SRM.酶法测血清TC时，由于血清中大部分胆固醇是酯化的，而血清基质对这些酶促反应有明显的影响，故不宜采用纯胆固醇结晶配制的溶液作为TC酶法分析的标准液，而应以准确定值的血清作为SRM,国际上有美国国家标准与技术研究所(NIST)的SRM909人血清及美国疾病控制中心(CDC)提供的定值人血清，我国已有国家技术监督局批准的人血清胆固醇标准物质”(国家一级标准GBW09138，卫生部北京老年医学研究所研制）。血清S