第二章发酵液预处理与固液分离.

《生物分离工程》BioseparationEngineering第二章发酵液预处理与固液分离生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性2.发酵液预处理与固液分离2.1发酵液预处理2.1.1引言2.1.2发酵液过滤性能的改变2.1.3发酵液的相对纯化2.2固液分离2.2.1过滤2.2.2离心预处理和固液分离内容固液分离发酵液胞外上清液/滤液预处理提取生化物质的第一步，分两部分：胞内富集细胞生物产品的分类（根据分离特点）：培养液产品：如饮料酒类，没有提取与精制，只需考虑除去固相杂质即可。细胞产品：如活性干酵母，只需固液分离和洗涤可溶性杂质的过程。粗制产品：如工业用酶制剂，只需考虑产品提取。精制产品：有纯度要求，大多数生物产品属此类，其分离回收过程一般包括预处理与固液分离、提取、精制和成品加工四步。精制产品分离纯化一般流程：胞外产品：发酵液↓预处理目的产物尽量进液相↓固液分离收集液相↓后提取与精制•胞内产品：发酵液↓预处理除杂、改变液相性质↓固－液分离收集细胞或菌体↓细胞破碎目的产物进液相↓固－液分离收集液相↓后提取与精制2.1发酵液预处理2.1.1引言发酵液预处理的目的：①改变滤液的性质②除去部分可溶性杂质③尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）——以利于后继各工序的顺利进行预处理的方法加水稀释法Dilutionwithwater加热法Heating调节悬浮液的pH值RegulationofpH凝聚和絮凝Coagulationandflocculation助滤剂Filteraids和反应剂Reactant高价无机离子的去除Removalofinorganicion杂蛋白的去除Removalofuselessprotein2.1.2发酵液过滤性能的改变生物悬浮液的特性：①悬浮物颗粒小，比重与液相相差不大；②固体粒子可压缩性大；③粘度大，含有蛋白质、多糖等胶体物质，大多为非牛顿型流体。改性的目的：降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。2.1.2.1加水稀释加水稀释法：虽能降低液相粘度，但会增加悬浮液的体积，加大后继过程的处理任务。后处理能耗产物浓度发酵液体积过滤速率粘度加水稀释2.1.2.2加热加热：可有效降低液相黏度，改善过滤性能。但加热的温度必须是在不影响目的产物活性的范围内。温度↑分离的复杂性胞内产物释放细胞溶解降目的产物活性有可能下过滤速率粘度热凝固蛋白质等胶体物质发生过滤速率粘度2.1.2.3调整pH对于氨基酸、蛋白质等两性物质，调pH至等电点，在等电点下溶解度最小，此即为等电点沉淀。在极端pH值下，蛋白质发生凝固，使之分离。可以使存在于胞内的发酵产物转入液相或使发酵产物以适合的离子状态或游离状态存在于发酵液中，防止其沉淀、氧化或变性等。通过调整pH值改变膜过滤中易吸附分子的电荷性质，可减少膜堵塞和污染。调整pH→改变某些物质的电荷性质与强度→发生絮凝→便于分离。细胞(碎片)及某些胶体物质在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。2.1.2.4凝聚与絮凝（1）凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒间双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。胶体稳定机理：菌体、蛋白质等胶体粒子表面都带负电荷↓在静电引力作用下形成双电层↓保持胶体的分散状态凝聚作用机理：加入电解质↓电解质中的高价阳离子对胶体周围离子的影响↓双电层电位↓↓胶体稳定性↓，发生凝聚电解质的凝聚能力可用凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（mmol/L)称为凝聚值。阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+常用的凝聚电解质有硫酸铝Al2(SO4)3·18H2O(明矾)、氯化铝AlCl3·6H2O、三氯化铁FeCl3·6H2O、硫酸亚铁FeSO4·7H2O、石灰、ZnSO4、MgCO3等。（2）絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。胶体粒子高分子絮凝剂静电引力范德华力氢键作用相互吸附作用形成絮团絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，具长链状结构，其链上含有许多活性功能团，包括带电荷的离子基团和不带电荷的非离子型基团。根据其来源的不同，常用絮凝剂分为如下三类：①有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；②无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；③天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。（3）混凝凝聚的特点是速度快，但颗粒小；絮凝的特点是速度慢，而颗粒较大。它们单独使用时效果较差，所以絮凝剂常与无机电解质凝聚剂搭配使用。首先加入电解质，使悬浮粒子间的双电层电位降低、脱稳、凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂絮凝成较大的颗粒。无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而大大提高了絮凝的效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。胶体悬浮液↓加入电解质粒子间的排斥作用降低、脱稳、凝聚成微粒↓加入絮凝剂絮凝成较大的颗粒2.1.2.5加入助滤剂助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒。常用的助滤剂有硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩、白土、碳粒、淀粉等。悬浮液↓加入助滤剂悬浮液中的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上↓滤饼的结构改变，可压缩性下降↓过滤阻力降低，过滤速率提高助滤剂使用要点：（1）根据目的产物选择助滤剂品种：当目的产物为液相时，要注意目的产物是否会被助滤剂吸附；当目的产物为固相时，要注意助滤剂对产品质量的影响。（2）根据过滤介质（如滤布）和过滤情况选择助滤剂品种：要注意防止泄漏和堵塞过滤介质。助滤剂使用要点：（3）粒度选择：助滤剂的粒度必须与悬浮液中固体粒子的尺寸相适应，颗粒较小的悬浮液应采用较细的助滤剂。（4）使用量的选择：助滤剂的使用量必须适合，使用量过少，起不到有效的作用；使用量过大，不仅浪费，而且会因助滤剂成为主要的滤饼阻力而使过滤速率下降。（过滤速率与使用量的关系）2.1.2.6加入反应剂（1）生成不溶性沉淀加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4等。产生的沉淀可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成磷酸钙沉淀，能使过滤速率提高3～10倍。（2）分解大分子物质如发酵液中含有多糖、蛋白质等高分子物质，可用内切酶分解，以提高过滤速率。例如万古霉素发酵液残留一定的淀粉，过滤前加入α-淀粉酶处理，配合硅藻土助滤剂，可使过滤速率提高5倍。2.1.3发酵液的相对纯化发酵液中的杂质不仅直接影响产品质量和收得率，同时对后继提取和精制有很大影响。高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+等）——影响离子交换法提取时树脂的交换容量。可溶性蛋白质——影响离子交换和吸附法提取时的交换容量和吸附能力；萃取时易产生乳化现象，使两相分离不清；膜过滤时，易堵塞或污染，影响过滤速率。2.1.3.1高价无机离子的去除（1）Ca2+——加草酸钠沉淀C2O4Na2+Ca2+→C2O4Ca↓+2Na+（2）Mg2+——加三聚磷酸钠形成络合物Na5P3O10+Mg2+→MgNa3P3O10+2Na+（3）Fe3+——加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+2.1.3.2杂蛋白质的去除（1）沉淀法酸性溶液：加阴离子沉淀，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等。碱性溶液：加阳离子沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等。（2）变性法加热变性：70～80℃，30min，蛋白质大多变性沉淀。酸碱变性：如在抗生素生产中，常将发酵液pH调至pH2～3或pH8～9使蛋白质凝固。有机溶剂变性：如酒精、丙酮等使蛋白质凝固。（3）吸附法——加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而去除2.2固液分离固液分离的方法很多，其中用于细胞悬浮液分离的主要是过滤和离心分离。霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，其细胞悬浮液大多采用过滤方法处理。细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，外形尺寸大多在1～10μm范围，一般采用高速离心机分离。采用絮凝和添加助滤剂等方法进行预处理后，细菌和酵母菌细胞悬浮液亦可采用过滤方法进行固液分离。（粒度、密度差；投资、能耗、适应性）过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。过滤介质filtermedium:过滤采用的多孔物质；滤浆filterpulp:所处理的悬浮液；滤液filtrate:通过多孔通道的液体；滤饼或滤渣filtercake:被截留的固体物质。2.2.1过滤板框过滤机是一种传统的过滤设备，可用于霉菌、放线菌、酵母等多种发酵液的固液分离。优点：固相含水份低，动力消耗低，适应不同过滤特性的发酵液的过滤。缺点：间歇操作、劳动强度大、生产效率较低。适合于固形物含量1~10%的悬浮液的分离。（1）板框过滤机板框压滤机包括板和框，多做成正方形，角端均开有小孔，装合压紧后即构成供滤浆或洗水流通的孔道。框的两侧覆以滤布，空框与滤布围成了容纳滤浆及滤饼的空间，滤板用以支撑滤布并提供滤液流出的通道。•板框式压滤机在过滤时，悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤浆通道打人框内，，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。滤饼充满滤框后停止过滤。（2）真空转鼓过滤机可用于霉菌、放线菌、酵母菌等细胞悬浮液的过滤分离。优点：操作连续，处理量大，适合于固形物含量大于10%的悬浮液的分离。缺点：不适合于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，所得固相的干度不如板框过滤。转筒真空过滤机结构：转筒，扇形格(18格)；滤室；分配头；动盘(18个孔，分别与扇形格的18个通道相连)；定盘(三个凹槽：滤液真空凹槽、洗水真空凹槽、压缩空气凹槽，分别将动盘的18个孔道分成三个通道)；滤浆槽。转筒下部浸入滤浆槽中，浸没角约900-1300，圆筒缓慢旋转时(转速约0.5-2r／min)，筒内每一空间相继与分配头中的3个室相通，可顺序进行过滤、洗涤、吸干、吹松、卸饼等项操作。即整个圆筒分为过滤区、洗涤及脱水区，卸渣及再生区3个区域。（3）错流过滤（Cross-FlowFiltration）在分离细菌、细胞碎片等悬浮液时，由于其固体颗粒细微，可压缩性大，所形成的滤饼阻力很大，随着过滤过程的进行，过滤速度迅速下降。因而一般过滤不适合细菌悬浮液的分离。错流过滤（Cross-FlowFiltration)又称切向流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走。错流过滤广泛用于细菌和细胞碎片的分离，缺点是固相（浓缩相）含液量较高，仅起浓缩作用。（4）澄清过滤当悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清，这种方法叫做澄清过滤。适合于固体含量少于0.1%(V)、颗粒直径较小的悬浮液的过滤分离，多用于需要除菌的场合。2.2.2离心是目前发酵生产中应用最广泛的固液分离技术，适合于各种微生物细胞悬浮液的分离。优点：分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等。