苜蓿愈伤组织的诱导与抗逆性突变体的筛选

1苜蓿愈伤组织的诱导与抗逆性突变体的筛选李波1李红2白庆武1王秀丽付园园1（齐齐哈尔大学生命科学与工程学院，黑龙江齐齐哈尔1610061）（黑龙江省畜牧研究所，黑龙江，齐齐哈尔1610002）摘要：对准格尔苜蓿进行了愈伤组织诱导的筛选，在MS的不同激素培养基中，2.4-D1、6-BA0.5为最佳激素配比；并以硫酸二乙酯（DES）和低温对苜蓿愈伤组织进行诱变处理，筛选其半致死浓度（DES处理1.5h为2.8%;2h为2.2%）和半致死温度为-5℃，并对诱变处理后的材料进行了脯氨酸含量测定，脯氨酸含量明显高于对照，筛选出了具有抗性的苜蓿愈伤组织，为苜蓿的抗性育种提供基础材料。关键词：苜蓿、愈伤组织、低温、DES人工诱变常用于提高植物抗逆性，在水稻、小麦、甘蔗和红豆草等多种植物中已获得变异细胞系，常表现出较强的耐逆性，并且能选育出抗逆性强的、能稳定遗传的优良品系。本文以化学药剂硫酸二乙酯（DES）和物理因素低温诱变苜蓿体细胞，以期为利用组培法进行抗逆性育种提供原始实验材料和资料。1．材料与方法１.１材料选择籽粒饱满、有光泽的准格尔苜蓿（MedicagoSativaL.cv.NeimengZhungeer）种子（由黑龙江省畜牧研究所提供）。消毒后用无菌水冲洗，将种子植入无激素MS固体培养基中萌发，经培养7～10d取出茎段（0.5cm）作愈伤组织诱导材料，每天光照12h,光照强度约1500Lx，温度为25℃。1．2方法1.２.１愈伤组织的诱导将MS培养基中培养7天左右无菌苗，待幼苗长出4个真叶，茎段粗壮时（5mm）植于L9(34)正交实验的培养基，附加不同激素，22—24℃、散射光下培养。9种培养基分别为：表1附加不同浓度激素的培养基Table1ThemediumofaddingdifferentconcentrationhormonesM1M2M3M4M5M6M7M8M9KT0001112222,4-D0.5120.5120.5126-BA0.20.510.510.210.20.51.2.2半致死温度的测定选取继代2次的白色松脆的愈伤组织切成直径为4-5mm的小块，接种于盛有继代培养基（MS+6-BA0.5+2,4-D1）的50ml三角烧瓶中，进行半致死温度的测定。冷冻程序在数字控制的低温离心机中进行。测试温度由室温（25℃）开始，经2h下降至0℃后，以人工控制，每下降１℃停留4h，误差上下小于0.5℃，从0℃到-10℃，温度每下降1℃取出分析样品。将全部经过冷冻的样品置于5℃条件下解冻，24h后置于25℃条件下继续培养，2周后观察半致死温度。1.2.3硫酸二乙酯对愈伤组织进行诱变处理愈伤组织切成约3mm2的小块，分别转入硫酸二乙酯不同浓度的MS液体培养基中，浸泡1、1.5和2h，然后用180目筛网滤出愈伤组织块，将其接种于新鲜的MS固体培养基中，在25℃培养。本实验诱变终止时用大量的的液体培养基冲洗。1.2.4脯氨酸含量的测定在测定样品游离脯氨酸含量时，现多采用Troll的酸性茚酸酮显色法。而对样品的前处理（提纯和纯化脯氨酸）却采用了不同的方法，本实验采用了磺基水杨酸法浸提样品中的游离脯氨酸。2结果及分析22.1愈伤组织的诱导表2中的结果显示,准格尔苜蓿愈伤组织的诱导在M2中出愈伤组织时间最短,出愈率最高,说明MS培养基中附加2,4-D为1,6-BA为0.5最适合此种苜蓿愈伤组织的诱导。表2苜蓿愈伤组织的诱导Table2ThecallusinductionofalfalfacallusM1M2M3M4M5M6M7M8M9出愈率(d)()(99999()(9((D)761110911131117诱导率(%)90%100%68.2%87%84.6%80%77%91.6%76,4%2.2愈伤组织低温半致死温度的测定愈伤组织小块低温处理后经过两周生长，部分小块褐化死亡。未褐化的小块继续分裂生长，其结果如表3。以50%愈伤组织没有发生冻死的最低温度为半致死温度，则愈伤组织小块低温半致死温度为-5℃。表3低温处理后苜蓿愈伤组织存活率Table3Thesurvivalrateofalfalfacallusinlowtemperaturestress温度（℃）250-1-2-3-4-5-6-7-8-9-10存活数（块）141210897542000总数（块）161212121212121212121212存活率（％）87100836775594233170002．3愈伤组织的半致死剂量从培养的细胞中筛选突变体时，诱变剂最适剂量的选择，不仅要考虑突变率的高低，而且还要考虑次级损伤的大小，尤其是对再生能力影响的大小，一般认为适宜的诱变剂量为半致死剂量。从表４可知，用硫酸二乙酯诱变苜蓿的愈伤组织，处理1.5h，半致死浓度为2.8%（v/v），其存活率为53.47%，接近50%；处理2h，半致死浓度为2.2%（v/v），其存活率为48.25%，也接近50%，所以硫酸二乙酯半致死浓度的测定受诱变条件和时间的控制，诱变条件和时间的不同，直接影响半致死浓度的改变。表4不同浓度DES处理苜蓿愈伤组织块的存活率Table4ThesurvivalrateofdifferentconcentrationofDEStreatedalfalfacallus浸泡时间（h）DES浓度（v/v）愈伤组织块总数（个）存活数（个）存活率（%）1011211199.110.41089890.741.01038986.401.616412073.172.21389770.292.8926469.571.501041041000.4898089.891.012010285.001.61158372.172.21479665.312.81015453.4720848398.810.41109182.731.01047269.271.61086057.4132.21145548.252.81224738.522．4脯氨酸含量的变化2．4．1低温处理脯氨酸的变化实验发现随着温度的逐渐降低，脯氨酸含量呈类抛物线状分布（见图1），即脯氨酸含量先逐渐增加，达到峰值（-6℃）后，脯氨酸含量又逐渐降低。脯氨酸含量的增加是因为低温这个选择压使苜蓿愈伤组织发生了基因突变，从而诱导体内相应的酶系和代谢过程，产生适应性的生理生化反应的结果。在-6℃以后，脯氨酸含量之所以又会降低，这是因为低于-6℃的温度会对苜蓿愈伤组织造成不可逆的伤害，引起其体内新陈代谢失调。在一定范围内，脯氨酸含量随着温度的降低而累积。00.20.40.60.811.2ck-1-3-5-7-9温度脯氨酸含量脯氨酸图1不同温度处理下愈伤组织脯氨酸含量的测定2.4.2DES处理愈伤组织脯氨酸的累积学者对许多材料的分析表明在正常情况下植物体内游离脯氨酸含量很低，但由图2可知，苜蓿的愈伤组织经DES处理后，游离脯氨酸含量明显增多。同一处理浓度，随处理时间延续（1、1.5、2h）脯氨酸含量减少，根据植物的抗逆机理，脯氨酸含量应随着时间的延续而累积增加，说明由于抗逆作用所增加的脯氨酸量远远弥补不了由致死细胞的增多所减少的游离脯氨酸量，所以导致后面的曲线呈现下降趋势。00.050.10.150.20.250.300.411.62.22.8DES诱变处理愈伤组织浓度(v/v)游离脯氨酸的累积量(mg/g)1h1.5h2h图2DES处理苜蓿愈伤组织脯氨酸累积量的变化3讨论3．1愈伤组织的调控外源激素的种类和用量对苜蓿愈伤组织的诱导起着重要作用。2，4-D在愈伤组织诱导过程中主要起促进作用，但浓度过高、过低均不利。6-BA多为抑制细胞分裂，促进细胞进入保守状态。在外植体培养愈伤组织时，需要细胞分裂素与生长素的配比维持在较低水平，但亦不可使激素浓度过高，这一结果与一般双子叶植物诱导外植体时需要较低的细胞分裂素与生长素的配比相一致。3.2低温作为选择压的诱变效果分析在植物抗性研究中，选择压的种类很多。包括各种化学诱变因子和物理诱变因子。在本实验中我们选用低温作为选择压，通过实验结果分析，可以看到在一定范围内，随着温度的不断降低，脯氨酸逐渐累积。这说明低温作为选择压起到了预定的效果，使苜蓿愈伤组织发生了突变，而且相对于其它选择压来说，低温有其自身的优点，诱变条件简单、易得，而且价格低廉，对人畜4没有伤害，安全无毒。所以低温是筛选抗寒性突变体的优良的选择压。3.3硫酸二乙酯诱变苜蓿的愈伤组织脯氨酸的动态变化分析从图2观察可知，在处理时间为1h，脯氨酸的含量随处理浓度的增大而逐渐增多；在处理时间为1.5h，在半致死浓度之前，脯氨酸的含量也随处理浓度的增大逐渐增多，在硫酸二乙酯浓度为2.2%时出现一个峰值，为0.211mg/g；在2.2%之后，脯氨酸的含量呈下降趋势但仍比初始值要高；在处理时间为2h，脯氨酸的含量在硫酸二乙酯浓度为1.6%时出现一个峰值为0.159mg/g，以后随着浓度的增加，脯氨酸下降幅度较大，在半致死浓度为2.8%时，脯氨酸含量下降到0.035mg/g，仅比未经药剂处理的脯氨酸高，综上所述，考虑存活率、突变率、抗逆性几方面因素，选择硫酸二乙酯处理浓度为2.2%，时间为2h是一个最佳的处理条件。植物的抗逆性与脯氨酸含量的变化存在相关性。通过测试诱变和低温处理后的愈伤组织的脯氨酸含量的变化，可以推知用硫酸二乙酯和低温诱变苜蓿的愈伤组织可以提高其抗逆性，可为今后的选择抗性育种工作奠定良好的基础。参考文献1、XUYun-yuan,JLAJing-Fen.SelectionandCharacterizationofCulturedAlfalfaCullusesResistanttoEthionine，actaPhytophsiologicasinica.2001,27(1):49～542、傅润民.果树瓜类生物工程育种.[M]农业出版社.1994:1723、张志良.植物生理实验指导〔M〕.高等教育出版社.1990:259～2604、张殿忠,江沛洪,赵会贤.测定小麦叶片游离脯氨酸的方法〔J〕.植物生理学通讯.1990,（4）:62～655、汤章城.逆境条件下植物脯氨酸的累积及其可能的意义〔J〕.植物生理学通讯.1984(1):15-216、周瑞莲，王刚．水分胁迫下端粒保护酶活力变化及脯氨酸累积在其抗旱中的作用[J]草业学报，1997，6（4）7、赵云,王茂林.油菜细胞诱变及抗草酸突变体的筛选〔J〕.中国油料.1996,18（4）：10～148、王荣富，植物抗寒指标的种类及其应用，植物生理学通讯。1987（3）：49—559、马建忠，植物的冷诱导基因，农业生物技术学报，1996：4（1）：8—1410、黄小云，自然降温过程中草珊瑚抗寒适应性研究，重庆师范学院学报，(2)：66—70