第二讲体外受精.

第十章：动物配子与胚胎生物工程第一讲：体外受精技术一．概述二．卵母细胞的体外成熟三．卵子和精子的体外受精四．早期胚胎的体外培养五．影响体外受精的因素六．应用前景一、概述（一）定义从狭义上讲，体外受精（invitrofertilization）是指将动物受精过程中的精卵结合在体外环境下完成的一种现象，包括自然条件下的体外受精（两栖类和鱼类的正常生殖过程）和人为培养条件下的体外受精（哺乳动物）。哺乳动物的体外受精实质将精子和卵子分别从公、母畜体内取出并经过一系列的处理，使精卵在体外条件下结合的过程。体外受精的主要内容包括：1）卵母细胞的体外成熟(invitromaturation,IVM)2）卵子精子体外受精(invitrofertilization,IVF)；3）受精卵的体外培养(invitroculture,IVC)。体外受精程序(二)体外受精的意义一、提高动物繁殖力的有效措施(精卵)二、体外受精可为胚胎移植提供充足而廉价的胚胎,为工厂化生产胚胎提供可能三、为其他动物繁殖生物技术，如动物克隆、动物转基因工程和胚胎干细胞等研究提供丰富的试验材料和必要的研究手段四、有利于揭示受精的本质和机理，并有助于研究胚胎的分化和发育。（三）研究历史体外受精是在20世纪80年代初研究成功,并在近10年得到逐步完善的一项配子与胚胎生物技术,1959年，张明觉利用获能处理的家兔精子进行体外受精实验，获得了世界上第一批体外受精的试管小兔;1982年，美国学者Brackett等成功报道世界首例体内成熟的卵母细胞经体外受精获得试管牛；体外成熟卵母细胞和完全体外化的试管牛也分别于1986年和1988年报道成功。目前,一套高效的牛胚胎体外生产程序已经建立起来,并逐步进入生产推广的产业化阶段。我国体外受精技术的研究起步于80年代后期，但进展很快，已先后在人和牛等8种动物取得成功。特别是人和牛的体外受精技术已达到国际先进水平，每年约有近千例试管婴儿诞生。二、卵母细胞的体外成熟（一）卵母细胞的采集1.离体卵巢采卵母畜屠宰后，取出卵巢并方如盛有消毒的PBS或生理盐水的保温瓶（25~30℃）中，在4~6小时之内送到实验室。从卵巢上回收卵母细胞主要有两种方法：（1）卵泡抽吸法用5~10ml的注射器连接一支16号针头，将针头插入卵泡而抽吸卵母细胞。此法的优点是容易操作且速度较快，但回收率偏低（60~80%）且易损伤卵母细胞周围的卵球细胞从而影响卵母细胞的质量（2）卵巢解剖法首先用手术剪刀将卵巢上的卵泡单个的剪下，然后在盛有回收液的器皿中用经消毒的刀片划破卵泡，最后将器皿置于解剖显微镜下收集卵母细胞。此法的优点是回收率高，可达90%以上。但操作复杂回收速度较慢而且容易造成污染。2．活体采卵卵母细胞的活体采集是通过体外受精技术生产良种胚胎的一种主要途径。因从屠宰场收集到的卵巢种质一般都相对较差，而通过对良种动物反复进行活体采卵可获得大量种质优良的卵母细胞，其胚胎生产的效率要比超数排卵高出数倍，且对动物的生产性能和生殖机能无太大影响。（1）腹腔镜法在腹壁切开一小口,插入腹腔镜、操作杆和穿刺针,通过操作杆和穿刺针的配合将卵母细胞抽吸出来。该法的优点是比较直观,容易掌握；缺点是工作量大,对母牛有损伤,不能频繁手术。（2）B超引导法将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到阴道子宫颈的一侧穹隆处，术者通过直肠将卵巢贴在探头上，根据B超屏幕上所显示的卵泡位置进行穿刺而将卵泡抽出。该法的优点是不用手术，操作的速度较快，对母牛的损伤较少，可频繁对母牛进行采卵，亦可对妊娠母牛进行采卵；缺点是操作技术较难掌握，并需要昂贵的超声设备。据研究报道，母牛可每周采卵2次，每次可获得5~6枚卵母细胞，且持续2~3个月对母牛无不良影响。（二）卵母细胞的体外成熟1．培养液用于卵母细胞体外成熟的基础培养液有TCM199，Ham’sF-10，Menezo’sB2，NUSC23和MEM等，其中应用最广泛的是TCM199。这些基础培养液上需添加一定浓度的血清（5~10%的FCS或ECS）和促性腺激素等成分。激素对卵母细胞体外成熟的作用不确定：在有血清存在的条件下，激素对卵母细胞体外成熟的作用不大，浓度过高反而有一定的副作用；但在无血清存在的条件下，激素则对卵母细胞的受精能力和胚胎发育能力均有一定促进作用。2．培养时间对大多数家畜来讲，卵母细胞的成熟培养时间一般采用22~24小时，但猪多采用40~44小时，马多采用30~36小时。时间过短，虽然卵母细胞已达核成熟，但细胞质尚未充分成熟；而培养时间过长，势必因卵母细胞的代谢底物不足而影响其活力，最终导致受精率和胚胎发育率下降。3．温度和气相人和啮齿类动物的卵母细胞体外成熟采用37℃，牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞成熟培养温度均采用38~39℃。研究表明，牛卵母细胞在38.5℃培养16小时后再在37℃培养8小时可以提高其分裂率和囊胚发育率。由于目前采用的培养液大都以HCO3-作为酸碱缓冲体系，故需维持一定浓度CO2的气相环境来保持培养液的酸碱度，否则会因为培养液中CO2的逸出而使培养液的pH升高，一般采用5%的CO2。4．培养系统卵母细胞的成熟培养系统大致可分为：（1）开放培养系统将1~2ml成熟培养液直接置于平皿内或五孔培养板内，然后放入50~200枚卵母细胞进行培养，上面不盖石蜡油。该系统的优点是简单，对培养液中的脂溶性物质没有影响，且同时能培养大量的卵母细胞；缺点是渗透压的变化较大，容易污染，故培养液的量和培养向内的湿度要特别注意。该系统根据平皿的运动状态分为静止培养系统和摇动培养系统两种，如采用静止培养系统时应在成熟培养液中加入一定浓度的FSH(0.1ug/ml),否则会因卵母细胞的严重贴壁而使卵母细胞变形。（2）微滴培养系统将成熟培养液先在组织培养皿中做成50~500ul的微滴，上覆石蜡油，然后将卵母细胞置于其中培养。该系统的优点是成熟培养液中的渗透压比较稳定，且不易污染；缺点是对培养液中的脂溶性物质有稀释作用，且成本较高，培养结果易受石蜡油影响。此法适用于多组对比实验，或来源于不同母畜的卵母细胞的分别培养等。（3）密闭培养系统将卵母细胞置于含有1~2ml成熟培养液的试管中，加盖胶塞，然后在培养箱或恒温水浴中培养；如若采用培养皿或微滴培养，则可将其装入一个密闭的塑料袋中。该法的优点是不需要CO2培养箱，方便运输；缺点是pH不如前者稳定。三．卵子和精子的体外受精（一）精子的制备精液中含有大量的精浆和精子获能的抑制因子，在体外受精前必须将其去掉。如是冷冻精液，其中还含有防冻剂和蛋黄等成分，这些成分将可能干扰正常受精过程，受精前亦有必要将其去掉。此外，精子的活力亦是影响体外受精的重要因素之一，过多的死精子留在受精液中将不利于卵母细胞的受精完成，也应将其去掉。因此，精子的分离于制备实体外受精激素的一个关键环节。1．悬浮法将精液置于含有1~5ml获能液或受精液的试管底部，在培养箱中培养10~30min后,吸取上层液体,而后离心洗涤1~2次,即可获得高活力的洁净精子。此法适用于精子活力较差的精液,但精子往上游动不充分,利用率低,对于价格昂贵的优良种畜精液应慎重考虑。2．玻璃棉过滤法许多实验室采用小玻璃珠柱层过滤法来滤除已稀释牛精液中的死精子，此法可大大节约精子的制备时间，但器材较昂贵。3．哌可（Percoll）密度梯度离心法根据形态正常精子的密度高于异常的精子,经平衡离心后形态正常的获能精子将集中于高密度的哌可区,从而分离的到高受精力的精子。常用的哌可密度梯度为30%和45%,平衡离心10min,梯度离心法可分离得到更高质量的精子,且精子的利用率也较高。但哌可梯度离心法分离得到精子的体外受精效果易受哌可质量影响。4．离心洗涤法取0.1~0.2ml的精液放入含有5~10ml的获能液或受精液的离心管中，而后离心2次即可。此法的优点是操作简单，精子的利用率高。但需在受精前估算精子的活力，因为从此法获得的精子没有经过活精子的筛选。（二）精子的获能1．肝素处理法此法是目前应用广泛的精子获能处理方法。将一定浓度的肝素直接添加到受精液中进行受精，受精液中的肝素浓度一般为2~10ug/ml，应注意的是，不同的动物要求不同浓度的肝素。2．钙离子载体法钙离子载体A23187可直接诱发Ca2+进入精子细胞内，提高细胞内的Ca2+浓度，从而引起精子获能。处理方法是，首先将精子加入含有0.5~1.0umol/L的不含的受精液中处理约5min，然后加入等量的含1%BSA的受精液，以终止A23187的作用，随后精子可用于体外受精。3．高渗溶液处理法据报道，当精子与高渗溶液作用时，精子表面富含的被膜蛋白将脱落，从而导致精子获能。一般用的高渗溶液为360~380mosm。虽然如此高渗的溶液对精子有一定的高渗打击，但受精效果不错，故至今仍有人使用此法。4．卵泡液处理法卵泡液含有来自血清的大分子物质，且含有诱发精子获能和顶体反应的因子，故在培养液中加入一定浓度的卵泡液将有可能诱发精子的获能。但卵泡液含有精子活动的抑制因子，因此，卵泡液可用于精子的获能处理，但不能用于体外受精系统。5．血清白蛋白溶液孵育血清白蛋白是血清中的大分子物质，具有很强的结合胆固醇和锌离子的能力，可除去精子质膜中的部分胆固醇和锌离子，降低胆固醇在精子质膜中的比例，进而改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。但该法需要时间较长，且诱发精子获能的作用不强，目前仅作为精子获能的一种辅助手段。（三）受精方法1．微滴法此法是目前应用最为广泛的一种受精方法。其做法是先在培养皿中用受精液制作成20ul或40ul的微滴并覆盖石蜡油，置于CO2培养箱中平衡至少2小时。然后，每滴放入10~20枚已培养成熟的卵母细胞和经处理的精子，精子在受精液滴中的最终浓度一般为1~2×106ml。应指出的是，不同的公牛要求不同的精子浓度。2．四孔培养板法首先在四孔培养板的每孔中放入0.5~1.0ml的受精液，置于CO2培养箱中平衡至少2小时。然后，每孔放入50~100枚已培养成熟的卵母细胞和经处理的精子，精子在受精液滴中的最终浓度同上。3、精子显微注射受精（1）卵子的收集和处理目前用于显微注射的卵可以通过激素超排的方法获得，也可采用体外成熟的卵子。卵母细胞在注射前采用0.1%透明质酸酶除去卵丘细胞，对于脂肪含量较多的牛和猪卵母细胞，还应对其进行离心处理，以便使卵母细胞中的脂肪滴被甩向一侧，胞质变的透明，便于注射的操作。（2）精子或精核的制备精子注射前，要对其进行孵育获能处理。如果注射的是精子的头，则需要对其进行超声波处理和蔗糖密度梯度离心分离精子的头。制备好的精子可单独置于含有8%~10%聚乙烯吡咯烷酮或甲基纤维素的操作液微滴中。此外,可在精子注射的操作液中加入5mmol/L的二硫苏糖醇,可使注入卵胞质的精核更易发生解聚。（3）精子或精核的显微注射目前用于精子显微注射的方法有常规和压电子素微操作法，两者主要在注射管及驱动动力上有区别。前者需要斜口针，且要拉一针尖，后者使用平口针即可。（4）卵子的激活目前激活卵母细胞常用的方法有钙离子载体A23187处理、电激、酒精处理、离子霉素+6二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、离子霉素+放线菌酮(CHX)等。目前，较为有效的激活方法是先用5umol/L的离子霉素激活处理卵子5min，然后在含有2mmol/L6-DMAP的培养液中培养3小时。四、早期胚胎的体外培养（一）培养液早期胚胎的体外培养液一般可分为简单培养液和复合培养液。简单培养液，如CR1液、BMOC-3液.CZB液和SOF(syntheticoviductfluid)液等，复合培养液，如TCM199、CMRL1066、HamF-10液等。所有培养液的基本成分主要包括无机盐、碳水化合物、氨基酸、蛋白质、维生素及其他的生长因子等。按其功用可分为渗透压维持因子、代谢底物和代谢调节因子。1、培养液中的无机盐主要包括Na+、Cl-、K+、Mg2+、Ca2+、PO43-、SO42-和HCO32-等。Na+、Cl-调节渗透压。2、能量底物亦是胚胎培养液中的一种重要成分，包括葡萄糖、乳酸钠