血红蛋白的提取和分离---基础知识

第15课时血红蛋白的提取和分离1.归纳蛋白质多样性的原因(1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。(2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。(3)图丙说明：氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。(4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞含有血红蛋白，使红细胞呈现红色。3.红细胞放到低渗溶液中，会吸收水分，体积膨胀直至涨破。课堂导入蛋白质是生命活动不可缺少的物质，随着基因组测序工作的完成，人们对蛋白质的研究和应用工作进入了新的时代，这就需要获得纯度较高的蛋白质。因此对蛋白质的分离就是生物学研究中经常要做的工作，下面我们就以血红蛋白的提取和分离来学习有关蛋白质的一些基本技术。探究点一蛋白质分离技术生物体内的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子的之间的差异来分离的。1.蛋白质特性的差异(1)分子的形状和大小；(2)所带电荷的性质和多少；(3)溶解度；(4)吸附性质；(5)对其他分子的亲和力。2.分离的方法(1)凝胶色谱法Ⅰ.概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。Ⅱ.凝胶：是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。Ⅲ.凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A)相对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大大于凝胶颗粒空隙直径、被排阻在凝胶颗粒的外面垂直向下移动较快较短先从凝胶柱洗脱出来小小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入凝胶颗粒内部垂直向下移动，无规则扩散进入凝胶颗粒较慢较长后从凝胶柱洗脱出来Ⅳ.分离蛋白质的过程(如图B)①蛋白质混合物上柱；②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外；③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动；④相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。(2)电泳①概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。②原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。③常用方法a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状的不同而不同，从而得以分离。b.聚丙烯酰胺凝胶电泳加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。(3)缓冲溶液①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱或稀释的影响，维持pH基本不变的溶液叫做缓冲溶液。②缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。小贴士缓冲溶液常见的有三类1弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。2多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如：NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。3弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。归纳提炼凝胶色谱法和电泳法凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。活学活用1.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因()A.分子带电性质的差异B.分子的大小C.分子的形状D.分子的变性温度[问题导析]电泳法是在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。答案D解析电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。探究点二血红蛋白的提取和分离每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质不同会有很大差异，下面以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离蛋白质的方法。1.蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。2.样品处理(1)红细胞的洗涤①目的：去除杂蛋白；②方法：采集血样，低速短时间离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水稀释，再离心，重复三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。(2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中：①加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破；②加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜；③置于磁力搅拌器上充分搅拌10min，其作用是加速红细胞破裂；④红细胞破裂，释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液①将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层：②将试管中的液体用滤纸过滤、除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。(4)透析①原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。②过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。③目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质。b.用于更换样品的缓冲液。3.凝胶色谱柱的制作(1)取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。(2)柱底部制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。(3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。(4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。4.凝胶色谱柱的装填(1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量↓(2)凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液↓(3)固定：将色谱柱垂直固定在支架上↓(4)装填：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内↓(5)洗涤平衡：用20mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密5.纯度鉴定——电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。归纳提炼实验注意事项(1)红细胞的洗涤①离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。②重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。(2)色谱柱填料的处理：为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。(3)凝胶色谱柱的装填：在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。①在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。②在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。(4)蛋白质的分离：滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。活学活用2.下列说法不正确的是()A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变B.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程D.透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内[问题导析]透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。答案D解析透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()A.路程较长，移动速度较慢B.路程较长，移动速度较快C.路程较短，移动速度较慢D.路程较短，移动速度较快答案D解析凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。2.在血红蛋白分离过程中，使用缓冲液的作用是()A.维持溶液浓度不变B.维持溶液酸碱度不变C.催化蛋白质分离过程顺利完成D.无实际意义答案B解析分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。3.下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的叙述，正确的是()A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12h答案C解析红细胞洗涤步骤中应加入生理盐水而不是蒸馏水，血红蛋白释放中加入蒸馏水，透析时缓冲液pH应为7.0而不是4.0。4.凝胶色谱柱制作成功的标志是()A.凝胶装填紧密、均匀B.凝胶色谱柱中有气泡C.洗脱中，红色区带均匀一致地移动D.洗脱中，红色区带偏向左边移动答案C解析洗脱过程中，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。5.凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答下列问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由__________________________替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)若选用SephadexG－100，则“G”表示_____________________________________