紫花苜蓿对铅污染土壤修复能力及其机理的研究

1紫花苜蓿对铅污染土壤修复能力及其机理的研究叶春和*（济南大学地理系250022,济南）摘要以10mmol/LPb(NO3)2处理紫花苜蓿幼苗10d，分析了Pb在紫花苜蓿幼苗根、茎、叶中的积累情况、Pb在根表皮细胞中的亚细胞区域化特点及Pb在紫花苜蓿体内的主要存在形式。结果表明，Pb在紫花苜蓿幼苗中积累量（M）特点为：M根M茎M叶。同时X-ray微区分析显示，胞间隙是紫花苜蓿积累Pb浓度最高的部位，细胞壁和液泡次之，胞质中最低。Pb的存在形式分析表明Pb在紫花苜蓿体内主要以难溶的形式存在，另外BSO能够加剧Pb污染对紫花苜蓿幼苗Pn和生长的抑制作用，表明紫花苜蓿对Pb的耐受与植物络和素的形成有关。这些都表明紫花苜蓿对Pb具有一定的耐受机制，避免其对胞质代谢的毒性。同时紫花苜蓿具有很高的生物量和对Pb较高的富集作用，因此是一种很有利用价值的土壤铅污染修复植物。关键词土壤修复紫花苜蓿X-ray微区分析随着世界人口的快速增长和工业的迅猛发展，土壤这一人类赖以生存的必需资源正承受着越来越大的压力。因受到工业三废和农用化学品以及矿区的污染，有相当数量农田的土壤质量日趋下降。在我国由于重金属污染而引起的粮食减产达1000万吨/年，直接经济损失达100多亿元。在西方发达国家和其他发展中国家也存在着类似的问题。土壤修复问题受到人们越来越多的关注，在部分西方国家土壤修复正发展成为一个新兴的环境产业。1998年9月，第16届国际土壤学大会在法国Motepellier召开，土壤修复问题成为大会的一个热点。2000年10月第一届土壤修复国际学术会议在中国杭州召开。对重金属污染土壤修复的措施主要包括物理、化学和生物学措施（bioremediation）。其中物理和化学措施主要是通过降低有重金属（Pb、Cd、Cu、Zn等）的可溶性和生物可获得性（bioavailability），从而减小其毒害作用。近年来，土壤修复研究中生物学措施(主要是植物修复技术：phytoremediation)以其过程简单、成本低廉和不存在安全隐患等特点受到了人们越来越多的关注，在这一方面已有很多成功的例子[1、2、3]，即通过对特定重金属具有超富集作用的植物从被污染土壤中吸取（phytoextract）重金属离子从而减少其在土壤中的含量，达到土壤修复（remediation）的目的。植物修复技术是一种很有潜力、正在发展的环境修复技术，也是一门正在崛起并涉及土壤学、植物学、环境工程等多门学科的新兴边缘学科[4]。已有报*Email:[e-mail]2道紫花苜蓿（MedicagosativaL.）对镍和铜离子具有较高的富集作用，是一种很有应用前景的土壤修复植物[5、6、7]。但就其对铅的富集能力和机理问题尚缺少全面的研究，基于此，本文研究了Pb(NO3)2处理下紫花苜蓿幼苗体内铅的积累、亚细胞分布、结合形态和Pb污染环境下BSO(buthioninesulfoximine,一种植物络合素的合成抑制剂)对紫花苜蓿光合作用和生长的效应，以期就紫花苜蓿对铅的富集能力和机理进行初步的探讨。1材料与方法1.1植物材料和污染处理将紫花苜蓿(MedicagosativaL.)种子（采自山东省陵县）播种于装有洗净细砂的花盆（直径20cm，高25cm）中。萌发后，每天浇灌Hoagland营养液一次。长出三个复叶后选择生长一致的健壮幼苗每盆保留10株。在第10片复叶出现时，用10mmol/LPb(NO3)2溶液处理紫花苜蓿幼苗，每天浇灌两次，早晚各一次。每个处理6个重复。处理10d后，取样测定各项指标。1.2试定内容和方法1.2.1光合速率的测定以美国产Li-6400便携式光合仪测定紫花苜蓿幼苗叶片的净光合速率(Pn)，光强为1600Lx，温度为32℃。1.2.2紫花苜蓿幼苗体不同部位Pb含量的分析收获整株植物，用蒸馏水冲洗干净，以吸水纸吸干其表面水分，小心分成根、茎以及叶片三部分，放入120℃烘箱中杀青后，以85℃恒温烘干24h，称重后，取少量放入马伏炉中510℃灰化12h，室温冷却后用一滴浓HNO3消化，以去离子水定容至500ml后，用日立Z-8000原子吸收光谱仪测定溶液的Pb含量。1.2.3Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞中的微区分布将制备好的切片在配有EDAX-9100能谱仪的日立H-800型透射电镜下进行测定，加速电压为150KV，取出角为25°，样品的测量计数时间为60s，测出的数值分别表示扣除背底后的每种元素的X-ray计数值（CPS）。在检测时，对每一组织区域所测定的微区，至少测试30个点，求出其平均值[8]。1.2.4紫花苜蓿幼苗根和叶片中Pb的化学形态分析用逐步提取法研究紫花苜蓿幼苗根和叶片中Pb的化学形态[9]。提取剂及提取顺序为80%乙醇、去离子水、1molNaCl溶液、2%醋酸、0.6mol盐酸。分别称取4.000g紫花苜蓿幼苗根和叶片新鲜样品，剪成的碎片，置于烧杯中，加入37.5ml3提取剂，在30℃恒温箱中放置过夜，次日回收提取液，再加入同样体积该提取液，侵取2h后再回收提取液，重复2次，即在24h内提取4次，集4次提取液（共150ml）于烧杯中。提取液经蒸发近干后，用一定比例硝酸-高氯酸消化，用10%硝酸定容，用日立Z-8000原子吸收光谱仪测定溶液中Pb的含量。80%乙醇提取以硝酸盐、氯化物为主的无机盐以及氨基酸盐等;去离子水提取水溶性有机酸盐、重金属的一代磷酸盐等;1molNaCl溶液提取果胶酸盐、与蛋白质结合态或吸着态的重金属等;2%醋酸提取难溶性的重金属磷酸盐等;0.6mol盐酸提取草酸盐等。2实验结果2.1Pb污染对紫花苜蓿幼苗体内Pb水平的影响紫花苜蓿幼苗在以含有10mmol/LPb(NO3)2的Hoagland培养液处理10d后，其根、茎以及叶片内的Pb水平极显著升高，而根部比其它部位积累的多，具体地说，根中Pb水平分别是茎的22.43倍，叶片的35.466倍。（表1）表1.Pb在紫花苜蓿幼苗不同部位中的含量Table1.PbcontentsindifferentpartsofM.sativaseedlings处理紫花苜蓿不同部位中的Pb含量（μg/gDW）根茎叶对照15.3120.3416.1710mmol/LPb12134.21541.08342.172.2Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞中的微区分布用X-ray分别测定了紫花苜蓿幼苗根表皮细胞的细胞壁、细胞质、液泡以及细胞间隙中的Pb相对含量。结果表明，对照植株根细胞及细胞间隙中的Pb含量可能太低而没有测出。但是Pb处理的紫花苜蓿幼苗根细胞的细胞壁、细胞质、液泡和细胞间隙中积累了大量的Pb，其中细胞间隙中Pb含量最高，细胞壁和液泡次之，细胞质中的最低，具体来讲，细胞间隙、细胞壁和液泡中的Pb含量分别是细胞质中的3.19、2.47和1.70倍（图1，表2）。表2.Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞中的区域化Table2.CompartmentationofPbinrootepidermalcellsofM.sativaseedlingsdeterminedwithX-raymicroanalysis处理紫花苜蓿幼苗根表皮细胞不同部位中的Pb含量（CPS）4细胞壁细胞质液泡细胞间隙对照000010mmol/LPb69.9928.3148.2690.33*表中数据由图1.中的能谱计算而得CPS（countpersecond）：X-ray计数单位图1.Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞中微区分布的能谱图A细胞间隙（处理）B液泡（处理）C细胞质（处理）D液泡（对照）2.3紫花苜蓿幼苗根和叶片中Pb的化学形态紫花苜蓿幼苗根和叶片内Pb化学形态的实验结果表明，在Pb污染下，Pb的醋酸（HAc）提取态和盐酸（HCl）提取态是紫花苜蓿幼苗根内Pb的主要化学形态，它们分别占根中总含Pb量的36%和33%左右。其它形态的含量相对较低，它们的大小顺序为：FHAcFHClFEthanol（12.6%）FNaCl（9.9%）FWater（7.7%）FResidue（0.2%）。在叶片中Pb的主要提取形态与根中的相似，HCl提取态和HAc提取态是主要形态，它们大约分别占叶片中总含Pb量的41%和20%（表3）。表3.紫花苜蓿幼苗根和叶片内Pb化学形态的含量Table3.ThecontentsofvariousPbformsinleavesandrootsofM.sativaseedlings（F:form）器官处理不同Pb化学形态的含量(μg/gDW)FEthanolFWaterFNaClFHAcFHClFResidue5根对照1.841.472.564.892.374.9110mmol/LPb1541.11943.661208.434431.344105.4726.88叶对照1.051.812.211.412.410.9210mmol/LPb60.7240.2144.7588.23182.4626.372.4BSO对Pb污染下紫花苜蓿幼苗光合作用和生长的影响从图2和表4可以看出，1.0mmol/LPb处理后，紫花苜蓿幼苗光合速率和生长下降。BSO对对照紫花苜蓿幼苗的光合作用和生长没有影响，而对Pb污染紫花苜蓿幼苗光合作用和生长的影响较明显（不加BSO幼苗的Pn和干重分别是加BSO幼苗的1.5和1.2倍）。051015202501Pb(NO3)2concentration(mmol)Pn(umolCO2/m2·s)NoBSOBSO图2.BSO对Pb污染和对照组紫花苜蓿幼苗光合作用的影响Fig2.EffectofBSOonphotosynthesisofM.sativaseedlingswithandwithoutPbcontamination表4.BSO对Pb污染和对照组紫花苜蓿幼苗生长的影响Table4.EffectofBSOonthegrowthofM.sativaseedlingswithorwithoutPbcontamination不同处理条件下每株紫花苜蓿的干重（g/plant）0mmol/LPb0mmol/LPb+BSO1.0mmol/LPb1.0mmol/LPb+BSO0.520.530.480.40*处理10d后的数据3讨论本实验结果表示，在Pb污染环境下，进入紫花苜蓿幼苗体内的绝大部分Pb被富集在根部，而迁移至其它部位的较少。这支持Ye的结果[10]。由于大部分Pb积累在紫花苜蓿根部，从而减轻了地上部分各器官的毒害作用，一定程度上提高了紫花苜蓿对Pb的耐性。紫花苜6蓿根部富集Pb的机理可能涉及到植物体能限制Pb从根部运输到植株茎、叶部分；紫花苜蓿根部具有积累Pb的能力；地上部分具有一定拒Pb的能力或地上部分能把吸收到的Pb重新运回根部等。但是至今还没有一个较合理地解释紫花苜蓿吸收或运输Pb的机理。从X-ray微区分析结果可以看出，Pb在紫花苜蓿幼苗根表皮细胞内的微区分布明显不同。绝大部分Pb都沉积在细胞间隙（质外体）中，这与前人以其它植物为材料的研究结果是一致的[10、11、12、13]。说明在Pb污染下，植物根部细胞的质外体可视为重要的Pb离子贮存场所。Pb被局限在代谢活性较低的区域（质外体、细胞壁和液泡），从而阻止过多的Pb进入原生质体，这样，细胞质内的一些重要物质和代谢活动在一定程度上可免受Pb毒害，使紫花苜蓿对Pb表现出一定的耐性。化学存在形式分析表明紫花苜蓿幼苗体内Pb的存在，无论在根部或叶片内，都是以HAc和HCl提取态占绝对优势，也就是说，进入紫花苜蓿体内的Pb多与一些物质结合形成毒性较低的难溶性化合物，而自由态的Pb含量相对较低，以致它的毒害作用也比较小[14]。所以紫花苜蓿对Pb的耐性在一定程度上是由于Pb在其体内的存在形式造成的。另外，由于富集在紫花苜蓿根部的Pb是以难溶的HAc和HCL提取态占优势，所以它就不容易由根部向地上部分迁移。另外BSO能够加剧Pb污染对紫花苜蓿幼苗Pn和生长的抑制作用，表明紫花苜蓿对Pb的耐受与植物络和素的形成有关。综上所述，紫花苜蓿