紫锥菊中菊苣酸的提取工艺和含量测定

紫锥菊提取菊苣酸的工艺与含量测定研究紫锥菊中菊苣酸的提取一般采用水、甲醇、乙醇和超临界萃取，但是由于：水提取温度高，容易造成菊苣酸的氧化；甲醇提取容易造成有机溶剂残留，降低产品的质量并带来不安全因素，因此不适合工业化；超临界萃取由于成本较高，收率低，尚未完成工业化研究。因此本试验采用乙醇作为工业化提取溶剂，并且对所提菊苣酸含量进行测定实验研究，旨在为紫锥菊提取菊苣酸的深入研究和市场开发提供依据：一、紫锥菊提取菊苣酸工艺与含量测定实验仪器与材料准备Agilent1100高效液相色谱仪；G1313A自动进样器；G1315BDAD二极管阵列检测器；UV-2450紫外-可见分光光度计；AG285分析天平；Milli-Q超纯水仪；DZ-2BC型真空干燥箱紫锥菊药材地上部分→自然干燥→粉碎；菊苣酸对照品，供含量测定用；色谱测定用水为超纯水；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。二、紫锥菊提取菊苣酸的提取方法与结果（一）紫锥菊中菊苣酸的提取1.紫锥菊提取溶剂的选择分别称取10g紫锥菊药材地上部分8份，以10倍质量的0.20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇水溶液加热回流提取2h→所得滤液浓缩后蒸干→采用HPLC测定菊苣酸的含量→计算其得率。结果见图1:由上图可见，随着乙醇体积分数的增加，菊苣酸的逐渐升高（得率=出膏率x干膏中菊苣酸的质量分数），当乙醇溶液的体积分数为60%时，得率最高。随后，菊苣酸的得率随乙醇体积分数的增加而降低。因此选择60%乙醇作为提取溶剂。2.正交试验设计在预实验的基础上，选择溶剂体积(A)、提取时间(B)、提取次数(C)作为3因素，进行L9（34）的正交试验。分别称取10g紫锥菊药材→按L9(34)正交表所列条件加入60%乙醇回流加热→滤过→滤液浓缩后置已干燥至恒重的蒸发皿中水浴蒸干后→于70℃干燥12h→置干燥器中冷却30min→迅速称重并密闭保存。采用出膏率及菊苣酸得率作为提取工艺的评价指标，用加权综合评分，按照出膏率和菊苣酸得率的权重比(4：6)计算，并对实验结果进行分析，结果见表表1，2，3：（二）紫锥菊提取菊苣酸结果与分析从表2和表3可以看出，3因素的影响大小依次为ACB，溶剂体积对出膏率和菊苣酸的得率影响最大。最佳组合条件为A3B2C3，从降低成本、节约能耗考虑，在保证充分提取的前提下，综合分析各个因素对出膏率和菊苣酸的转移率的影响，确定提取工艺为12倍量60%乙醇回流加热提取3次，每次1.5h，合并滤液，浓缩后水浴蒸干，于70℃干燥12h，置干燥器中冷却30min，得干膏。（三）紫锥菊提取菊苣酸所选条件的验证试验为验证所选条件的合理性，取紫锥菊药材地上部分共3批，各100g，按确定的提取工艺进行放大试验，测得出膏率均值为21.20%（RSD0.94%），菊苣酸的得率均值为1.025%（RSD1.08%），说明该工艺条件稳定、可行。（四）紫锥菊提取菊苣酸含量的HPLC测定1.色谱条件色谱柱Z0rbaxSBC18(4.6mmx150mm，5μm)；流动相乙腈-1.0%；冰醋酸溶液（25：75）；流速1.0mL·min-1；柱温35℃；检测波长328nm；进样量10μL。2.对照品溶液的制备精密称取在60℃减压干燥4h的菊苣酸对照品适量，加60%乙醇制成每mL含0.050mg的溶液，即得。3.供试品溶液的制备取紫锥菊药材地上部分10g→按确定的提取工艺制备干燥浸膏→取0.050g，置具塞锥形瓶中→精密加入60%乙醇50mL→密塞→精密称定质量→超声(功率250W，频率35kHz)提取10min→冷却至室温→称量并以60%乙醇补足重量→以0.45μm微孔滤膜过滤→取续滤液备用。4.标准曲线的绘制精密称取菊苣酸对照品适量→加60%乙醇制成11μg.mL-1菊苣酸对照品溶液→精密吸取上述溶液1，10，20，40，60，80，100μL进样→测定峰面积。以菊苣酸峰面积值为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得线性方程Y=7.8808X-60.652，r=0.9998，线性范围0.011~1.100mg。5.精密度试验取”2.对照品溶液的制备”项下菊苣酸对照品溶液，分次进样，各6次，记录峰面积。计算结果，RSD0.64%（n=6）。6.稳定性试验“3.供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液6份，每隔2h进样，分别测定峰面积，结果RSD0.71%（n=6），说明样品在12h内稳定。7.重复性试验取同一批紫锥菊药材制备6份供试品溶液，按”1.色谱条件”项下色谱条件独立测定6次，测得菊苣酸质量浓度分别为92.97，92.23，93.04，92.29，92.55，92.86μg.mL-1，RSD0.38%。8.回收率试验精密称取同一批已知含量的紫锥菊药材6份，分别精密加入一定量的菊苣酸对照品，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果平均回收率99.51%，RSD1.01%。（五）样品测定取3批紫锥菊药材地上部分，按”3.供试品溶液的制备”项下制备供试品，进样测定峰面积，计算菊苣酸的质量分数，分别为1.031%，0.969%，1.028%。色谱图见图2。三、紫锥菊提取菊苣酸提取工艺和含量测定实验结果讨论（一）紫锥菊提取菊苣酸提取工艺和含量测定实验结果以上实验证明，波长在328nm时，紫锥菊提取菊苣酸检测灵敏度高，故确定检测波长为328nm。实验中还对供试品的制备进行了方法学考察，分别以水、30%乙醇、60%乙醇、甲醇超声提取15min，结果表明60%乙醇提取的菊苣酸含量较高。以60%乙醇为提取溶剂，考察了超声15min、回流1h、室温浸渍6h，结果表明超声提取率最高，且超声提取法操作简便、省时。同时对超声时间进行了比较，分别超声提取5、10、15min，结果15min和10min提取结果基本一致，表明超声10min时基本提取完全。最终以60%乙醇超声提取10min为供试品溶液的最佳制备方法。实验中进行了流动相的选择，曾比较了乙腈0.2%磷酸溶液（25：75）、乙腈-2.0%冰醋酸溶液（20：80）、乙腈-1.0%冰醋酸溶液（22：78）等不同比例，结果使用乙腈-1.0%冰醋酸溶液（25：75）的分离效果最好，峰型、出峰时间适宜。（二）实验结果讨论菊苣酸作为紫锥菊提取物中极为重要的活性成分之一，具有增强免疫功能和抗炎作用，可用于治疗伤风感冒，其制剂在美国市场销售额达3亿美元。近年来（源森生物实验室近期研究）的药理研究表明，紫锥菊提取菊苣酸还能够抗氧化、抑制HIV整合酶并促进胰岛素的释放。本次实验在对紫锥菊提取菊苣酸的工艺和含量测定进行研究后发现，紫锥菊菊苣酸乙醇溶剂提取方法操作简单、方便，成本低，避开了水提、甲醇提、超临界萃取的各项不足，适用于大批量工业化生产。