组培实验设计性实验方案

正交实验法研究铁皮石斛原球茎分化影响条件[摘要]利用6-BA、IBA、NAA和外源添加物四个因素三水平进行L9(34)正交实验,研究各因素对铁皮石斛原球茎分化的影响.对实验统计通过极差分析及均值分析,结果表明:当6-BA的浓度为2mg/L、IBA浓度为0.5mg/L、NAA浓度为0.75mg/L和外源添加物为苹果（50g/L）时,原球茎最易于分化成丛生小苗;影响原球茎分化程度的因素依次为6-BA浓度﹥外源添加物﹥NAA浓度﹥IBA浓度。[关键词]铁皮石斛；组织培养；原球茎分化；正交实验。1前言1.1目的意义铁皮石斛(DendrobiumcandidumWall．exLindl．)为兰科石斛属多年生附生型草本植物，别名铁皮兰，因其茎节处呈黑褐色，又名黑节草[1]。利用石斛茎尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来,石斛组织培养技术逐步走向深入化。目前,有关铁皮石斛的原球茎分化和生根条件的研究大都基于单因素试验,如不同培养基、激素浓度、无机盐浓度、碳源、pH等以及香蕉、马铃薯等附加物[2]。但是铁皮石斛原球茎分化及生根受培养基中综合因素的共同影响,不同因子的合理配置决定着培养基的科学性和高效性.运用正交实验设计可以精简试验次数、克服培养基配方设计的盲目性、大大提高工作效率和试验的可靠性。1.2研究进展自1960年法国人Gmorel利用石斛茎尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来,石斛组织培养技术逐步走向深入化.目前,有关铁皮石斛的原球茎分化和生根条件的研究大都基于单因素试验,如不同培养基、激素浓度、无机盐浓度、碳源、pH等以及香蕉、马铃薯等附加物.运用正交实验设计可以精简试验次数、克服培养基配方设计的盲目性、大大提高工作效率和试验的可靠性.广东省植物研究所关于籼稻花药的离体培养的报道,还相继在兰科植物中得到了应用[3],但尚未应用于铁皮石斛的离体培养.本实验利用6-BA、IBA、pH和培养基种类、琼脂浓度、KCl浓度各三因素三水平及空白对照分别设计两套L9(34)正交实验[4],以期分别得到有利于铁皮石斛原球茎分化和生根的理想培养基配方.在20世纪70年代，谭文澄等就进行铁皮石斛兰组织培养研究并获得完整植株。到今天，铁皮石斛的组织快繁依然是热点。归纳起来，当前铁皮石斛的组织快繁可分为种子无菌萌发、试管苗原球茎发生和试管苗器官发生3种途径。袁正仿等将铁皮石斛带茎节的茎段接种于培养基上(N6+2．5mg·L－1BA)诱导茎节发芽，再将芽接种于培养基上(N6+2．5mg·L－1BA+0．5mg·L－1IBA)诱导出原球茎，并指出只有将诱导出的小植株再诱导，诱导出大量的原球茎，才能扩大其繁殖。秦廷豪用铁皮石斛茎段、带顶芽的茎段和根蔸3类外植体在培养基上(MS+0.5mg·L－16-BA+0．2mg·L－1NAA)培养，仅根蔸能诱导出原球茎。王春等研究表明，铁皮石斛原球茎诱导最佳培养基为1/2MS+1.0mg·L－1BA+0.5mg·L－1NAA，诱导率为58%。王丽萍等研究表明，选用铁皮石斛幼嫩茎段为外植体诱导出原球茎的最佳培养基为MS+0.5mg·L－16-BA+0.5mg·L－1NAA+1.0mg·L－12，4-D。郑宽瑜等.以铁皮石斛种子为外植体诱导出原球茎。苏钛等.研究表明，BA相对于其他激素对铁皮石斛原球茎诱导效果最好，以2.0mg·L－1BA诱导率最高[5]。周俊辉等研究表明，以1.0mg·L－1NAA诱导铁皮石斛生根效果最明显。袁正仿等将铁皮石斛原球茎接种在分化培养基上(N6+1.5mg·L－1BA+1.2mg·L－1NAA+5%香蕉汁)诱导原球茎分化，结果表明，添加一定浓度的土豆汁、香蕉汁有利于原球茎分化，且添加浓度直接影响分化率和分化时间;用N6+2.5mg·L－1NAA+10%香蕉汁培养基使苗快速长高，把长高的苗转接到培养基上(N6+2.5mg·L－1NAA+10%土豆汁)，使茎变得粗壮[6]。徐雪荣等研究表明，铁皮石斛原球茎最佳分化培养基是MS+0.3mg·L－16-BA+3.0%白糖，分化率为74%;分化出的丛芽接种在生根培养基中(MS+0.05%AC+3.0%白糖)，28d生根率达到87%。朱艳等研究表明，铁皮石斛丛生芽在培养基上(1/2MS+10%香蕉汁+0.5%AC)生根效果最好。林丛发等研究表明，最适于铁皮石斛原球茎分化的培养基是1/2MS+0.5mg·L－1NAA+20%马铃薯汁+20g·L－1蔗糖+0.8g·L－1琼脂。王春等研究表明，铁皮石斛不定芽最佳生根培养基为1/2MS+0.5mg·L－1NAA，生根率为100%，平均生根数为7.1条[7]。1.3拟解决的关键问题1.3.1探究不同激素对圆球茎分化的影响，得出影响最深的因素；1.3.2通过该探究得出铁皮石斛原球茎分化最理想培养基配方。2材料与方法2.1材料2.1.1实验材料。铁皮石斛一代圆球茎。2.1.2仪器设备。超净工作台、接种器械、高压灭菌锅、烧杯、量筒、容量瓶、滴管、天平等。2.1.3实验试剂及用具。MS培养基、6-BA、IBA、NAA、外源添加物(香蕉、马铃薯、苹果)、琼脂、75%酒精、0.1%升汞、蒸馏水。2.2方法2.2.1实验方法对6-BA、IBA、NAA及外源添加物四因素选取三水平研究其对原球茎分化的影响(表1),设计正交实验形成9个不同的处理.将原球茎增殖后形成的拟原球茎分成直径0.15-1.0cm大小接入待检培养基中,基本培养基为MS培养基,附加琼脂4g/L,培养温度25±1℃,每日光照12h,光照强度1600-2500lx，9个待检培养基处理分别接种5瓶,每瓶接种3个点,每个20个左右，重复3次,一段时间后统计并参照下列公式计算繁殖系数.诱导产生芽的数量圆球茎外植体的总数表1铁皮石斛原球茎分化的参试因素及三水平表2分化条件正交试验设计因素水平123A6-BA浓度mg/L0.524BIBA浓度mg/L00.20.5CNAA浓度mg/L0.250.50.75D外源添加物香蕉30g/L马铃薯50g/L苹果50g/L实验处理ABCD1111121223313324223152313621227332183133繁殖系数=2.2.2统计分析依据方开泰的正交试验统计方法,对统计的数据利用Excel软件自编程序进行极差处理。表3结果记录表4结果分析(均值与极差分析）A：K1=(1.07+1.27+1.48)/3=1.273K2=(1.71+2.3+1.51)/3=1.84极差（R）=1.84—1.273=0.567K3=(1.59+2.14+1.63)/3=1.787B:K1=(1.07+1.51+2.14)/3=1.573K2=(1.27+1.71+1.63)/3=1.537极差（R）=1.79—1.537=0.253K3=(1.48+2.3+1.59)/3=1.799321210（空白）处理12345678910诱导产生芽的数量320381445513690452478643488312实验处理ABCD繁殖系数111111.07212231.27313321.48422311.71523132.3621221.51733211.59831332.14932121.6310（空白）1.04均值1(K1)1.2731.5731.6671.457均值2(K2)1.841.5371.4571.54均值3(K3)1.7871.791.7771.903极差（R）0.5670.2530.320.446C:K1=(1.07+2.3+1.63)/3=1.667K2=(1.27+1.51+1.59)/3=1.457极差（R）=1.777—1.457=0.32K3=(1.48+1.71+2.14)/3=1.777D:K1=(1.07+1.71+1.59)/3=1.457K2=(1.48+1.51+1.63)/3=1.54极差（R）=1.903—1.457=0.446K3=(1.27+2.3+2.14)/3=1.9033结果与分析00.20.40.60.811.21.41.61.82均值1234因素均值柱形图均值1(K1)均值2(K2)均值3(K3)00.10.20.30.40.50.6因素1234极差值极差（R）极差（R）00.511.522.5系数12345678910处理繁殖系数繁殖系数3.1接种培养后,原球茎颜色由淡绿色开始变为淡黄绿色,基部为白色透明状;然后,原球茎开始出现膨大;一段时间后,每个原球茎的茎顶均长出2-3片幼叶;然后,原球茎分化形成簇生长的无根丛生芽,各处理组原球茎繁殖系数存在一定的差异.如表繁殖系数柱状图可看出,处理5、8繁殖系数较大，而处理1、2繁殖系数较小.据观察繁殖系数较大的处理其分化状况也相对较好,其中处理5原球茎分化状况及繁殖系数均较好。3.2不同处理对原球茎分化影响的直观分析见表4。从原球茎的繁殖系数和各因素的K值（均值）与极差(R)值的柱形图可知,该试验因素A（图中为1）即6-BA浓度的R值最大为0.567,而因素B（图中为2）即IBA的浓度的R值最小为0.253,因此可初步推断影响原球茎分化主次程度为A﹥D﹥C﹥B（即1﹥4﹥3﹥2）,可初步推断分化培养基的最优水平的组合为A2D3C3B3。4结论4.1三因素对原球茎分化的影响实验结果表明：IBA作为植物生长素能促进细胞的生长,具有低浓度更有利于植物生长的特性,因此当IBA为0.5mg/L时原球茎的分化状况最好；6-BA在植物细胞分化中至关重要,过高或过低浓度都对分化不利,因此2mg/L的浓度对圆球茎分化最有利；NAA浓度为0.75mg/L时，有利于圆球茎的分化；而外源添加物对圆球茎的分化也有很大影响，其中苹果最有利于圆球茎的分别年华生长。4.2本实验的创新点目前,有关铁皮石斛的原球茎分化和生根条件的研究大都基于单因素试验,如不同培养基、激素浓度、无机盐浓度、碳源、pH等以及香蕉、马铃薯等附加物[8].而本实验运用正交实验设计了多因素多水平，可以精简试验次数、克服培养基配方设计的盲目性、大大提高工作效率和试验的可靠性。5讨论5.1铁皮石斛原球茎诱导分化实验中污染产生的原因及防治措施。本实验采用的材料是从无菌培养瓶中取出的一代原球茎，所以材料是无菌的。因此产生污染的原因可能是：培养基或接种工具灭菌不彻底、接种室消毒不严、人员因素、超净工作台上的滤网过滤不彻底等等[9]。防治措施：改善接种室和培养室的环境条件，保证接种与培养环境清洁无菌、操作人员严格遵守无菌操作规程、培养基及接种工器具要严格灭菌，确保灭菌质量、在培养基中加入适量的抗生素等等[10]。参考文献[1]叶秀妹,刘炜婳,赖钟雄.铁皮石斛组织培养研究进展[J].亚热带农业研究，2012年01期。[2]周根余,谢薇,程磊.影响铁皮石斛原球茎生长的若干因素[J].江西科学,1999,(4):231-235.[3]黄闽敏,刘晓芳,曹青爽.寒兰组培苗生根培养的多因子正交试验研究[J].北方园艺,2009(4):53-55.[4]方开泰,马长兴.正交与均匀实验设计[M].北京:科学出版社,2001:35-52.[5]张明,夏鸿西.石斛组织培养研究进展[J].中国中药杂志,2000,25(6):323-326.[6]王国梅,韦鹏霄,岑秀芬.基本培养基和激素组合对金钗石斛原球茎增殖的影响[J].广西农业科学,2006,37(1):10-12.[7]常俊,丁小余,保曙琳,等.喇叭唇石斛组织培养的研究[J].中国中药杂志,2004,29(4):313-316[8]张启香,方炎明;铁皮石斛组织培养及试管苗营养器官和原球茎的结构观察[J];西北植物学报;2005年09期[9]谢寅峰,徐丽,王莹.霍山石斛组培丛生芽诱导增殖及生根技术[J].林业科技开发,2007,21(6):72-74.[10]陈兆贵,谭俊.不同激素配比对铁皮石斛组织培养的影响研究[J].惠州学院学报.2006(03)