细胞与亚细胞结构的分离

细胞与亚细胞结构的分离SeparationofCells&Organelles•生物学及医学研究一般涉及：整体、器官、组织、细胞、细胞器及分子水平。其中，细胞、细胞器及分子水平的研究，均需分离细胞或细胞器。一、从动物组织游离细胞(一)步骤(二)方法1、非酶法2、酶法二、细胞器的游离三、细胞与细胞器的分离(一)沉降法纯化细胞或细胞器1、差速离心2、密度梯度沉降(1)速度沉降(2)等密度沉降平衡(二)电泳法分离细胞(三)亲和吸附法分离细胞(四)根据细胞的生物学特性分离细胞(五)流式细胞术分离细胞一、从动物组织游离细胞细胞的微环境cell-------------------cell----------extracellularmatrix(ECM)细胞连接(如连接蛋白)细胞粘附(ECM-R介导)细胞粘合(CAM介导)媒介：二价阳离子(尤其是Ca2+，如桥粒的中央层)；大分子(如糖蛋白和蛋白聚糖)•不同组织具有不同的细胞间质成分，不同组织中，参与细胞粘合与细胞连接的大分子成分也各不相同，所以，在游离细胞时，不同组织的细胞对不同试剂和不同方法具有不同的敏感性。------游离技术复杂，游离方法多样。•有时，同一种组织可用不同的方法游离出单个细胞，但所获得的细胞在表面性质、激素反应状态及物质和能量代谢上可能各有不同。------应根据实验目的选择游离方法。•游离方法成功-----细胞活率与产量均高，并尽可能地保留细胞结构与功能的完整性。•注意游离条件：1、游离剂的种类2、游离剂的浓度与作用时间3、缓冲液的成分4、pH5、溶液的渗透压与盐成分6、酶终止剂•对不同动物、不同组织或不同年龄的组织，有时游离方法不能通用。(一)步骤1、用利剪剪碎组织或切成0.3~0.4mm的薄片，必要时匀浆。------组织块应尽量细小，保证细胞的供氧。2、用游离剂处理，破坏细胞之间及细胞与ECM之间的联系------在组织与游离剂保温前，保持低温以降低氧的消耗；选用适当直径的容器，以便液面的高度适宜，利于组织块的氧供给。(二)游离细胞的方法1、非酶法------较温和(1)螯合剂(chelatingagent)----常用于游离上皮组织细胞常用：EDTA---结合Ca2+，Mg2+EGTA---结合Ca2+的能力与EDTA相似，但在中性或碱性条件下结合Mg2+的能力大大小于EDTA。去除Ca2+，Mg2+-----EDTA去Ca2+留Mg2+-----EGTA••常与酶联合使用，如细胞系传代常使用0.02%EDTA+0.25%胰蛋白酶(1:1或2:1)。•EDTA对某些细胞有损害，如可损伤线粒体等。-----尽量缩短细胞在无Ca2+或有EDTA环境中的时间。(2)甘氨酸(glycine)-----可与EDTA联合应用。(3)糖类(saccharide)----细胞表面的凝集素可识别并结合细胞粘合分子和细胞连接分子的糖链结构，这种作用能被相应的单糖、双糖或寡糖所抑制。（参见下页）(4)升高pH----改变细胞表面电荷如，胚胎组织，0.5%KOH溶液调至pH9.8，3~5分钟(5)机械力游离-----玻璃匀浆器，注射器(6#针头)。注意轻缓，减少膜撕裂。（许多癌组织中癌细胞间细胞连接减少、减弱，容易脱落形成转移灶，可直接用机械力游离。）2、酶法----蛋白水解酶，辅助酶几种酶或酶与非酶试剂联合使用，效果较好。(1)蛋白水解酶(proteolyticenzyme)粗胰酶(pancreatin)----混合酶，含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、RNA酶、脂酶、淀粉酶及磷酸酶。不同批号和来源的产品，其组成成分及各成分的活性变化很大----应根据需要选择不同来源的产品。防止支原体污染---酸性条件下处理胰酶10%胰酶，pH1，4~10℃数分钟(杀死各种微生物)过夜(杀死细菌的孢子)调回pH7，-20℃分装冻存备用。常用浓度0.01%~0.5%温度及时间37℃1～2分钟至1～2小时R.T.时间稍长4℃几小时甚至过夜0℃慢作用，时间长常用于游离单层培养细胞，作用时间尽可能短，以减少对细胞的损伤。牛血清中含有其抑制剂，可终止反应。结晶胰蛋白酶(trypsin)-----作用强烈，适于消化分散较软组织。由于其作用的特异性，限制了其水解能力。Ca2+、Mn2+并非其活性所必需，但可稳定此酶。可牢固附着在细胞表面，需加牛血清抑制其反应。胶原酶(collagenase)-----20多种，常与胰蛋白酶联合使用，适于消化坚硬癌组织中结缔组织的纤维成分。胶原酶灌流肝脏为游离肝细胞的首选方法。最适pH中性。属于金属酶(可能含Zn2+)，被Ca2+活化，被Mg2+抑制。牛血清不能使其灭活，其作用缓和，可用离心淘洗去除酶。商业上提供的胶原酶批号之间常有很大差异，购买时，先试几种不同来源的制品，选择效率高的，再按其批号一次足量购买。TrypsinCollagenase适于消化分散较软组织纤维多的组织用量0.01~0.5%0.1~0.3mg/ml(200u/ml)消化时间0.5~2hr(小块)1~12hrPH8~96.5~7.0作用强度强烈缓和对细胞的影响时间过长无大影响有影响血清能否抑制能不能Trypsin与Collagenase在不同温度下消化小块组织所需时间(hr)AB酶Trypsin(0.25%)Collagenase(200u/ml)A+B4℃24～2812～4824R.T.1～612～24637℃1～24～120.54℃12～1412～2412R.T.1～26～12337℃0.5～11～120.25•37℃/R.T.，Trypsin长时间(1hr)消化纤维性组织时，组织块表层细胞可随时从纤维网架中脱落下来，每隔20~30分钟需用不锈钢网/铜网(20~50μm)滤过一次，离心收集这些细胞，以免细胞受过度消化而被破坏。•大多数细胞直径10~100μm•从4℃取出后滤过一次向消化容器中补足新的Trypsin液离心（弃上清）37℃热消化20～30分钟已游离下来的细胞溶菌酶(lysozyme)------作用于细胞表面糖蛋白的某些糖苷键。游离小鼠肝细胞活率高（溶菌酶灌流、EDTA灌流）。弹性蛋白酶(elastase)----最适pH10，pH8~9活性也较高，pH6失活。如分离鸡胚的心肌细胞。结晶弹性蛋白酶不易溶于水，只含50~80%的活性酶。木瓜蛋白酶(papain)---是-SH酶，使用时应加入螯合剂，以防重金属与酶的-SH结合。2~3小时内稳定，不必外加蛋白酶抑制剂终止其作用。链霉蛋白酶(pronase)---广谱，Ca2+对其有保护作用，血清无终止作用。（1）pronase游离原代培养的人皮肤细胞比trypsin效果好：皮肤细块↓无Ca2+、Mg2+的盐溶液洗涤↓0.025%pronase，37℃保温（2）pronase游离体外培养的成纤维细胞比trypsin效果好，后者更适合于游离上皮细胞。（3）用pronase灌流肝脏，可得到活的Kuffer细胞和内皮细胞，而肝细胞则被破坏。（4）pronase也适于游离消化道粘膜细胞（单独或与collagenase联合使用）（5）pronase用于游离鸡胚的肌细胞。成纤维细胞→在FN上→增殖加快→在LN上→增殖减慢上皮细胞→在FN上→增殖减慢→在LN上→增殖加快原代培养的皮肤，若加大血清浓度(血清中含FN)，则上皮细胞生长不良，而成纤维细胞大量增殖。组织中FN/LN对于维持间质细胞/实质细胞的平衡有一定的作用。FN过多，可在创伤愈合时形成斑痕。(2)辅助酶(subsidiaryenzyme)DNA酶----部分细胞受损，DNA-蛋白质释放出来形成凝胶，凝集细胞。需Mg2+，可被Ca2+、Mg2+共同活化，使用时不能含有螯合剂。透明质酸酶(hyaluronidase)-----对热稳定，并具广泛的最适pH。可单独使用游离小肠粘膜细胞。•配制酶溶液----用BSS（平衡盐溶液）或培养液。终止蛋白酶作用的方法：(a)洗涤细胞，清除蛋白酶；(b)加入蛋白质竞争性地与酶结合，常用BSA等；(c)加入蛋白酶抑制剂----广泛存在于动、植物组织及血清中。*选择合适的蛋白酶及恰当的与酶搭配的蛋白酶抑制剂是获得高产率、高活率而减少细胞损伤的重要环节。防止细胞聚合的方法：(a)从组织游离细胞时，注意离散完全，减少对细胞的损伤；(b)用一定孔径的尼龙纱或铜网过滤，或以一定速度通过某种毛细管；(c)在细胞悬液中加入一定浓度的DNase或稳定剂。•稳定剂(protectiveagent)----也叫隔离剂，防止从组织游离下来的单个细胞发生聚合或粘附于瓶壁上，常用Methocel(一种甲基纤维素)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、明胶(gelatin)及BSA等。•成功地游离细胞-----精心选择游离试剂，注意pH、温度、离子种类和强度、作用时间及辅助试剂。方法的建立必须通过实验来摸索。•不同来源、不同批号的酶制剂可能有差异。二、细胞器的游离通过机械或化学的方法破坏细胞界膜和细胞内膜的连续性----制备组织或细胞匀浆。常用方法：1、Dounce玻璃匀浆器---手动，适于培养细胞和软组织细胞制备匀浆。2、Potter-Elvehjem匀浆器----电动或手动，适于软组织(如肝)的匀浆。3、叶片刀匀浆器(blader)---电动，适于较坚硬组织(如肌肉、心脏等)的匀浆。4、超声波匀浆器5、用爆发的负压破碎细胞界膜---适于细菌匀浆。三、细胞与细胞器的分离•细胞的分离：大小、密度---密度梯度沉降表面电荷---电泳表面特殊成分---亲和吸附•细胞器的分离：差速离心密度梯度沉降(一)沉降法纯化细胞或细胞器1、差速离心(differentialcentrifugation)在密度均一的介质中，分别在不同大小离心力场(从小到大)的作用下沉降而分离。（连续多次离心）由于各种颗粒于离心沉降前在介质中均均匀分布，所以，某些慢沉降颗粒被快沉降颗粒裹到后者的沉淀块中，而使分离不够完全-----可重复2~3次，进一步纯化。（将沉降物制成悬浮液，重新离心）由于连续离心会损伤细胞，所以，只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。细胞器在差速离心中的沉降顺序：核----线粒体----溶酶体与过氧化物酶体----内质网与高尔基体----核蛋白体由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，所以，差速离心分离得到的组分常不只一种，尤其是质膜常与各种细胞器混杂沉降。差速离心可将细胞器初步分离，再进一步通过密度梯度沉降进行分离纯化。分离的细胞器还需经过鉴定。各种细胞器都有其标志物，如溶酶体的标志物为酸性磷酸酶。肝匀浆↓重力作用下自然下沉，20'下沉物上清(沉渣、整细胞、纤维)↓1,000gx20'下沉物上清(核)↓10,000gx20'下沉物（还需进一步分离纯化）上清(线粒体、溶酶体、过氧化物酶体)↓100,500gx120'下沉物上清(微粒体)0.26%脱氧胆酸钠↓105,000gx20'下沉物上清(上层为内质网，下层为核蛋白体)各种细胞器的主要标志物细胞器标志酶细胞核DNA聚合酶、RNA聚合酶线粒体琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、心脂酶内质网葡萄糖6磷酸酶、细胞色素P450溶酶体酸性磷酸酶过氧化物酶体过氧化氢酶、尿酸氧化酶（类核体，人类及鸟类无）高尔基体半乳糖基转移酶、唾液酸基转移酶质膜腺苷酸环化酶2、密度梯度沉降(densitysedimentation)用一定的介质在试管中形成连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部或底部，通过重力或离心力场的作用，使细胞分层分离。分为速度沉降和等密度沉降平衡。(1)速度沉降(velocitysedimentation)细胞或细胞器在十分平缓的密度梯度介质中，按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。介质密度较低，最大密度小于被分离生物颗粒的最小密度。分离亚细胞结构，需加离心力场。在沉降最快的生物颗粒达到管底前停止沉降，并将各部分别收集。低温下进行，保