细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程

细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程1．原代培养（primaryculture）直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。这种培养称之为原代培养。2．传代培养（subculture）细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。3．悬浮培养（suspensionculture）细胞培养的一种类型。培养时通过一特殊的装置，使细胞瓶按一定的速度不断地转动，使细胞始终处于悬浮状态中进行增殖。4．克隆（clone）克隆指的是从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population）。5．细胞系（cellline）在第二届细胞和组织培养专题讨论会上提出细胞系的概念为“原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（lineagesofcells）所组成。如果不能继续传代或传代数有限，可称有限细胞系（finitecellline），如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continouscellline）。以前认为细胞系来自细胞发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限的传下去。这种细胞的特点是染色体为异倍体，丧失了正常细胞的“接触抑制”的特性。6．细胞株（cellstrain）细胞株的概念如下：由原代培养中，用选择或克隆代，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株，这些特性或标记在以后的培养中必须保持下去。以前认为经体外传代培养后细胞不表现退化现象，大约可传50代以上者，其染色体维持二倍体不变，保留正常细胞的“接触抑制”等特性。一常用设备一准备室的设备：双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。二培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。二无菌操作无菌技术是在医疗护理操作过程中，保持无菌物品、无菌区域不被污染、防止病原微生物侵入人体的一系列操作技术。无菌技术作为预防医院感染的一项重要而基础的技术，医护人员必须正确熟练地掌握，在技术操作中严守操作规程，以确保病人安全，防止医源性感染的发生。一、无菌技术的概念和原则（一）无菌技术的概念1.无菌技术是指在执行医疗、护理技术过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。2.无菌物品经过物理或化学方法灭菌后，未被污染的物品称无菌物品。3.无菌区域经过灭菌处理而未被污染的区域，称无菌区域。4.非无菌物品或区域未经灭菌或经灭菌后被污染的物品或区域，称非无菌物品或区域。（二）无菌技术操作原则1.环境清洁进行无菌技术操作前半小时，停止卫生处理，减少人员走动，以降低室内空气中的尘埃。治疗室每日用紫外线灯照射消毒一次。2.工作人员无菌操作前，衣帽穿戴整洁，口罩遮住口鼻，修剪指甲、洗手。3.物品管理无菌物品必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包外注明物品名称，有效期一周为宜，并按有效期先后顺序排放。无菌物品和非无菌物品应分别放置。无菌物品一经使用或过期，潮湿应重新进行灭菌处理。4.取无菌物操作者身距无菌区20cm，取无菌物品时须用无菌持物钳（镊），不可触及无菌物品或跨越无菌区域，手臂应保持在腰部以上。无菌物品取出后，不可过久暴露，若未使用，也不可放回无菌包或无菌容器内。疑有污染，不得使用。5.一物一人，一套无菌物品，只供一个病人使用，以防交叉感染。二、几种无菌技术的基本操作法（一）工作帽的应用戴工作帽可防止头发上的灰尘及微生物落下造成污染。护理传染病人时，也可保护自己，工作帽大小适宜，头发全部塞入帽内，不得外露。每周更换两次，手术室或严密隔离单位，应每次更换。（二）口罩的应用戴口罩可防止飞沫污染无菌物品。口罩应盖住口鼻，系带松紧适宜，不可用污染的手触及。不用时不宜挂于胸前，应将清洁面向内折叠后，放入干净衣袋内。口罩一经潮湿，则病菌易于侵入，应及时更换。（三）洗手、刷手、消毒手1.洗手执行无菌操作、取用清洁物品之前，护理病人前后，接触污染物之后均应洗手。方法：用肥皂搓洗手掌、手背、指间、手指及关节，以环形动作搓擦。而后用流水冲洗双手，将皂沫全部冲净，必要时反复冲洗，最后用清洁小毛巾擦干双手。2.涮手即利用机械及化学作用去除手上污物及微生物的方法，是做好消毒隔离、预防交叉感染的重要措施。方法：取无菌刷蘸肥皂乳（或肥皂块），先刷指尖、然后刷手、腕、前臂、肘部到上臂下1／2段，特别要刷净甲沟、指间、腕部，无遗漏地刷洗三遍，每遍3分钟。刷洗时，双手稍抬高。每遍刷完后，用流水冲去肥皂沫，水由手、上臂至肘部淋下，手不能放在最低位，以免臂部的水返流到手。刷洗毕，用无菌小毛巾依次拭干手、臂。手、臂不可触碰其它物品，如污染必须重新刷洗。3.消毒手消毒液泡手能有效地去除手上的微生物。方法：刷洗后，双手及上臂下1／3伸入盛有消毒液的桶内，用无菌小毛巾轻擦洗皮肤5分钟，手不可触及桶口。浸泡毕，拧干小毛巾，揩去手、臂、消毒液，晾干。双手保持于胸前半伸位准备穿手术衣。（四）无菌持物钳（镊）的类别和使用法1.持物钳（镊）的类别临床常用的持物钳（镊）有卵圆钳、三叉钳和长、短镊子。卵圆钳：钳的柄部有两环，使用时手指套入环内，钳的下端（持物端）有两个小环，可用以夹取刀、剪、钳、镊、治疗碗及弯盘等。由于两环平行紧贴，不能持重物。三叉钳：结构和卵圆钳相似。不同处是钳的下端为三叉类，呈弧形向内弯曲。用以夹取盆、盒、瓶、罐等较重的物品。镊子：镊的尖端细小，使用时灵巧方便。适用于夹取棉球、棉签、针头、注射器、缝针等小物品。2.无菌持物钳（镊）的使用法（1）无菌持物钳（镊）应浸泡在盛有消毒溶液的无菌广口容器内，液面需超过轴节以上2－3cm或镊子1／2处。容器底部应垫无菌纱布，容器口上加盖。每个容器内只能放一把无菌持物钳（镊）。（2）取放无菌持物钳（镊）时，尖端闭合，不可触及容器口缘及溶液面以上的容器内壁。手指不可触摸浸泡部位。使用时保持尖端向下，不可倒转向上，以免消毒液倒流污染尖端。用后立即放回容器内，并将轴节打开。如取远处无菌物品时，无菌持物钳（镊）应连同容器移至无菌物品旁使用。（3）无菌持物钳（镊）不能触碰未经灭菌的物品，也不可用于换药或消毒皮肤。如被污染或可疑污染时，应重新消毒灭菌。（4）无菌持物钳（镊）及其浸泡容器，定期消毒灭菌，并更换消毒溶液及纱布。（五）无菌容器的使用法经灭菌处理的盛放无菌物品的器具称无菌容器。如无菌盒、贮槽、罐等。4.无菌容器应每周消毒灭菌一次。（六）无菌包的使用法无菌包布是用质厚、致密、未脱脂的棉布制成双层包布。其内可存放器械、敷料以及各种技术操作用物，经灭菌处理后备用。1.无菌包的包扎法将物品置于包布中间，内角盖过物品，并翻折一小角，而后折盖左右两角（角尖端向外翻折），盖上外角，系好带子，在包外注明物品名称和灭菌日期。2.无菌包的打开法取无菌包时，先查看名称，灭菌日期，是否开启、干燥。将无菌包放在清洁干燥的平面上，解开系带卷放于包布角下，依次揭左右角，最后揭开内角，注意手不可触及包布内面。用无菌钳取出所需物品，放在已备好的无菌区域内。如包内物品一次未用完，则按原折痕包好，注明开包时间，有效期为24时。如不慎污染包内物品或被浸湿，则需要重新灭菌。取小包内全部物品时，可将包托在手上打开。解开系带挽结，一手托住无菌包，另一手依次打开包布四角翻转塞入托包的手掌心内，准确地将包内物品放入无菌容器或无菌区域内（勿触碰容器口缘），盖好。（七）无菌盘的铺法将无菌治疗巾铺在清洁、干燥的治疗盘内，使其内面为无菌区，可放置无菌物品，以供治疗和护理操作使用。有效期限不超过4小时。1.无菌治疗巾的折叠法将双层棉布治疗巾横折2次，再向内对折，将开口边分别向外翻折对齐。2.无菌治疗巾的铺法手持治疗巾两开口外角呈双层展开，由远端向近端铺于治疗盘内。两手捏住治疗巾上层下边两外角向上呈扇形折叠三层，内面向外。3.取所需无菌物品放入无菌区内，覆盖上层无菌巾，使上、下层边缘对齐，多余部分向上反折。（八）无菌溶液的倒取法取无菌溶液瓶，擦净灰尘，核对标签，检查瓶盖有无松动，瓶壁有无裂痕，溶液有无沉淀、混浊、变色、絮状物。符合要求方可使用。揭去铝盖常规消毒瓶塞，以瓶签侧面位置为起点旋转消毒后，用无菌持物钳将瓶塞边缘向上翻起，再次消毒。以无菌持物钳夹提瓶盖，用另一手食指和中指撑入橡胶塞盖内拉出。先倒少量溶液于弯盘内，以冲洗瓶口，再由原处倒出溶液于无菌容器中；倒溶液时瓶签朝上。无菌溶液一次未用完时，按常规消毒瓶塞、盖好，注明开瓶时间。（九）无菌手套的戴法1.戴无菌手套洗净擦干双手。核对手套号码及有效期。打开手套袋，取滑石粉涂抹双手，注意避开无菌区。手套可分别或同时取出。双手分别捏住袋口外层，打开，一手持手套翻转折部分（手套内面），取出；另一手五指对准戴上。将戴好手套的手指插入另一只手套的翻折面（手套外面），取出，同法将另一手套戴好，戴手套时不可强拉。最后将两手套翻折面套在工作衣袖外面。注意手套外面为无菌区，应保持其无菌。手套戴好后，双手置胸前，以免污染。2.脱手套将手套口翻转脱下，不可用力强拉手套边缘或手指部分。一无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射；3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟；4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。二实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手；2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋；3.用75％酒精棉球擦净双手。三无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面；2.靠近酒精灯火焰操作；3.器皿使用前必须过火灭菌；4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火；5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸；6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染；三器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。7.高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消：1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。1.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。2.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。3.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持2