综合实验-几种乳制品中酪蛋白和乳糖的制备与鉴定(生化实验2)修改

1.实验目的学习从牛奶中分离酪蛋白和乳糖的原理；掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法；学习常用蛋白质和乳糖的鉴定方法。三种品牌牛奶中酪蛋白和乳糖的制备与鉴定2.实验原理乳制品中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了其蛋白质总量的80%。乳制品在pH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称为乳清蛋白。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水合能力强，分散性高，在乳中呈高分子状态。本实验利用等电点时溶解度最低的原理，将乳制品的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。乳制品中的糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖，由D-半乳糖分子与D-葡萄糖分子通过β-1,4糖苷键连接而成。乳糖不溶于乙醇，但乙醇混入乳糖水溶液中，乳糖就会结晶出来，从而达到分离的目的。3.器材与试剂三种品牌牛奶、电炉、温度计、pH计、离心机、离心管、抽滤装置、表面皿(或一次性培养皿)、分析天平(万分之一)、恒温水浴锅、蒸发皿、烧杯、量筒、试管、吸管。0.2mol/LpH4.7的醋酸(NaAc-HAc)缓冲液、冰醋酸、CaCO3粉末、95%乙醇、0.9%NaCl溶液、茚三酮溶液、10%NaOH溶液、1%CuSO4溶液、浓硝酸、本尼迪试剂。三种品牌牛奶中酪蛋白和乳糖的制备与鉴定4.实验操作（1）酪蛋白的分离：将20mL新鲜牛奶盛于50mL离心管中加热到40℃（在水浴锅中），在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸（NaAc-HAc）缓冲液20mL（提前在恒温水浴锅中预热）。用冰醋酸调节溶液pH至4.7（pH计，小心滴加；如过量，可用NaOH溶液调节），此时有絮状沉淀析出。将上述悬浮液冷却至室温，离心5min（5000rpm，注意平衡），上清液转移到烧杯中再加入CaCO3粉末中和冰醋酸（不需pH计，添加少量，沉淀不溶解即为过饱和。太多CaCO3会吸附上清液导致乳糖的损失）留作乳糖测定用，离心管中的沉淀即酪蛋白粗品。离心管中沉淀用蒸馏水洗涤3次，每次约20mL（用玻璃棒充分搅拌），离心5min（4000rpm，注意平衡），弃上清。往离心管的沉淀中加入约20mL95%乙醇，搅拌片刻，将离心管中的悬浊液转移到布氏漏斗抽滤（抽滤至没有明显变化，约20min）。将沉淀转移至表面皿，捣碎摊开风干（置于干燥箱中，3~4d），得到酪蛋白纯品。（2）乳糖的分离：将上述实验所得的上清液加热煮沸（小烧杯直接在电炉上加热，开始冒烟后，继续煮10分钟，通过热变性除去乳清蛋白），趁热过滤，除去沉淀的蛋白质和残余的CaCO3；将澄清滤液再在电炉上加热煮沸10分钟，再趁热过滤；滤液置于蒸发皿中，蒸气浴（将蒸发皿置于盛水的烧杯上，在电炉上加热至沸）浓缩至5mL左右（目视确定），冷却后转移至50mL离心管，加入20mL95%乙醇，密封4℃放置3~4d（冰箱），让乳糖充分结晶。（3）酪蛋白的含量测定、鉴定和乳糖晶体收集：酪蛋白完全干燥后准确称重，计算酪蛋白含量（g/100mL牛奶）。取0.20g酪蛋白颗粒于烧杯中，加入NaCl溶液12mL溶解。取4mL酪蛋白溶液（试管），加入茚三酮溶液约1mL，振荡，放入沸水浴（烧杯）中加热2-3min，观察溶液颜色变化（茚三酮反应：所有氨基酸及具有游离α-氨基和α-羧基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生（亮）黄色物质）。取4mL酪蛋白溶液（试管），加入10%NaOH溶液0.8mL后，滴入1%CuSO4溶液，振荡，观察溶液颜色变化（双缩脲反应：含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，能与碱性硫酸铜发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物）。取4mL酪蛋白溶液（试管），加入浓硝酸0.8mL后加热（沸水浴），观察现象，再加入10%NaOH溶液0.8mL，观察现象（黄色反应：含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸等遇硝酸后，可被硝化成黄色物质）。过滤（或抽滤）收集乳糖晶体，并用冷的95%乙醇洗涤晶体，干燥2d。（4）乳糖的含量测定及鉴定：称重干燥的乳糖晶体，计算牛奶中乳糖的含量。将乳糖晶体重新溶于水后，取2倍体积本尼迪特试剂（基于蓝色的碱性硫酸铜可被还原为红色的氧化亚铜的原理检查葡萄糖等还原糖的试剂），置沸水浴中加热数分钟，观察颜色变化。5.时间安排（1）12课时(8hr)：原理及操作讲解、酪蛋白分离、乳糖的结晶（周六或周日上午9:30-下午5:30）；（2）3课时(2hr)：酪蛋白含量测定及蛋白鉴定、乳糖晶体洗涤及干燥（下周二下午4:30-6:30）。（3）3课时(2hr)：乳糖含量测定及还原性鉴定（下周五下午4:30-6:30）。三种品牌牛奶中酪蛋白和乳糖的制备与鉴定6.讨论试分析实验各环节（包括材料和操作）对实验结果的影响。提示：牛奶变质、pH偏高或偏低、CaCO3加入过量、洗涤不充分或加热、离心、过滤操作不当等方面的影响。7.作业要求每组至少完成2个品牌牛奶的提取及测定，详细记录实验操作的现象及结果，并进行分析讨论。每人交1份实验报告（包含整个小组的实验结果）。三种品牌牛奶中酪蛋白和乳糖的制备与鉴定