缺氧应激对HepG-2细胞AFP和ICAM-1表达的影响

缺氧应激对HepG-2细胞AFP和ICAM-1表达的影响卢根林邓勇【摘要】目的探讨缺氧应激对HepG-2细胞甲胎蛋白（alphafetoprotein,AFP）和细胞间粘附分子（intercellularadhesionmolecule，ICAM）-1表达的影响。方法缺氧（5%O2、5%CO2、90%N2）和常氧培养HepG-2细胞。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定常氧组和缺氧12、24h组HepG-2细胞AFPmRNA和ICAM-1mRNA的表达量。流式细胞仪技术测定ICAM-1蛋白表达，放射免疫法(RIA）测定HepG-2细胞培养上清AFP蛋白表达。结果随着缺氧时间的延长HepG-2细胞的AFP、ICAM-1mRNA和蛋白表达量明显增高(P＜0.01）。结论缺氧应激上调HepG-2细胞AFP、ICAM-1基因表达。【关键词】缺氧应激HepG-2细胞甲胎蛋白细胞间粘附分子-1EffectsofhypoxiastressonexpressionsofAFPandICAM-1inHepG-2cellLUGen-lin*,DENGYong(*TheFirstDepartmentofGeneralSurgery,YiwucentralhospitalofZhejiangProvince,Yiwu332000,P.R.China)【Abstract】ObjectiveToinvestigatewhetherHypoxiastressenhancesexpressionsofAFPandICAM-1inHepG-2cellornot.MethodsHepG-2cellswereculturedunderhypoxia(5%O2,5%CO2and90%N2)for12,24hornormoxia.TheexpressionsofAFPandICAM-1mRNAinHepG-2cellweredeterminedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction（RT-PCR）.TheexpressionofICAM-1proteininHepG-2cellwasstudiedbyflowcytometryassay.TheexpressionofAFPproteininHepG-2cellwasdeterminedbyradio-immunityassay(RIA）.ResultsWiththehyopxiatimeinceasing,theexpressionsofAFPandICAM-1geneweredramaticallyenhanced(P＜0.01）.ConclusionHypoxiastressupregulatestheexpressionofAFPandICAM-1inHepG-2cell.【Keywords】HypoxiastressHepG-2cellAFPICAM-1缺氧应激（5%O2）促进HepG2细胞增殖活性[1]、粘附、侵袭和迁移能力[2]，但其分子机制尚不明确。本实验探讨缺氧应激（5%O2）对HepG-2细胞AFP和ICAM-1表达的影响。1.材料与方法1.1细胞株和主要试剂：人肝癌细胞株HepG-2引自兰州军区总医院实验科（来源于美国国立肿瘤研究所），胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品，MTT、DMSO和胰蛋白酶均为美国Sigma产品，RT-PCRKit购于Takara公司，Trizol为Invitrogen公司产品。人β-肌动蛋白（β-actin[3]）、AFP[4]和ICAM-1[5]基因聚合酶链反应引物序列如下：β-actin上游引物5′-GTACCACTGGCATCGTGATGGACT-3′，下游引物5′-ATCCACACGGAGTACTTGCGCTCA-3′，目的片段长度为600bp；AFP上游引物5′-GTTCCAGAACCTGTCACAAG-3′，下引物5′-CTTTGTTTGGAAGCATTCAACTGC-3′，目的片段长度为193bp；ICAM-1上游引物5′-TGGTAGCAGCCGCAGTCATA-3′，下引物5′-CTCCTTCCTGGCTTAGT-3′，目的片段长度为377bp；由Invitrogen公司合成。兔抗人ICAM-1多克隆抗体，羊抗兔IgG-FITC荧光标记二抗均购自武汉博士德公司，AFP试剂盒由上海生物制品研究所提供。1.2体外细胞培养及实验分组：人HepG-2细胞置灭活10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，于37oC、5%CO2培养箱中培养，每3-5天传代一次。缺氧12、24h组HepG-2细胞置37oC、5%O2、5%CO2、90%N2三气培养箱中分别培养12、24h。1.3RT-PCR：Trizol一步法提取细胞总RNA，电泳见28S、18S条带，以2.5μg总RNA为模板，以Takara公司的RandomPremier为引物进行逆转录反应合成cDNA。AFP和β-actinPCR的反应条件为：95oC预变性3min后，95oC变性30s、60oC退火30s、72oC延伸50s共35个循环，72oC延伸7min。ICAM-1和β-actinPCR的反应条件为：95oC预变性3min后，95oC变性30s、57oC退火30s、72oC延伸50s共35个循环，72oC延伸7min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，以AFP/β-actin和ICAM-1/β-actin值分别表示AFP、ICAM-1mRNA含量。基金项目：青海省卫生厅2006年指导性科研项目（200601）作者单位：332000义乌，浙江省义乌市中心医院普外一科（卢根林）；青海大学附属医院普通外二科（邓勇）第一作者简介：卢根林，1973年10月生，男，浙江省衢州市人，医学硕士,普通外科主治医师，电话[phone]Email:[e-mail]1.4HepG-2细胞ICAM-1表达量的测定：ICAM-1与肝癌细胞的转移能力有关，ICAM-1表达增加表示癌细胞的转移能力增强，ICAM-1可作为评价肝癌细胞生物学行为的标志之一。1.4.1培养细胞和取样取对数生长期的HepG-2细胞，按每孔5×105个接种于6孔板，常氧组HepG-2细胞于常氧培养24h；缺氧12、24h组HepG-2细胞于缺氧培养12、24h，收集细胞，离心，PBS洗涤2次，用75％冷乙醇（4oC）固定，4oC保存。1.4.2采用免疫荧光间接法检测细胞前经1500r/min离心5min，弃去乙醇，PBS洗涤2次，加20μl（1：20）兔抗人ICAM-1抗体，37oC水浴30min，PBS洗涤2次，加20μl（1：50）羊抗兔IgG-FITC荧光标记二抗，另设不加ICAM-1抗体只加IgG-FITC荧光标记二抗作为空白对照组，37oC水浴30min，PBS洗涤2次，4oC保存，待测。1.4.3流式细胞仪检测采用美国Becton-Dickson公司的FACSan流式细胞仪进行检测，每样品收集1×105个细胞，用Clifit软件进行分析。1.5HepG-2细胞培养上清AFP含量的测定：取处于对数生长期的HepG-2细胞,按每孔1×105个细胞接种于24孔培养板,常氧组HepG-2细胞于常氧培养24h；缺氧12、24h组HepG-2细胞于缺氧培养12、24h；吸取细胞培养上清经1000rpm离心15min，取上清用于AFP含量的RIA检测。1.6统计学处理:应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料用表示，多样本均数比较采用单因素方差分析，多样本均数间两两比较用q检验。2结果2.1HepG-2细胞AFP、ICAM-1mRNA表达:常氧组和缺氧12h、24h组总RNA的28S/18S=2：1，表明所提取的总RNA完整性好，可用于RT-PCR实验。图1、2和表1示：随着缺氧时间的延长HepG-2细胞的AFP、ICAM-1mRNA表达量明显增高(P＜0.01）。提示缺氧应激上调HepG-2细胞AFP、ICAM-1mRNA表达。2.2HepG-2细胞AFP、ICAM-1蛋白表达:图3和表1示：随着缺氧时间的延长HepG-2细胞的AFP、ICAM-1蛋白表达量明显增高(P＜0.01）。提示缺氧应激上调HepG-2细胞AFP、ICAM-1蛋白表达。表1缺氧应激对HepG2细胞CD54及AFP分子表达的影响(n=6,)组别CD54蛋白表达CD54mRNA表达AFP蛋白表达（ng/ml）AFPmRNA表达常氧组0.37±0.010.51±0.0226.17±3.380.42±0.05缺氧12h组0.51±0.02*0.68±0.03*44.25±3.87*0.52±0.05*缺氧24h组0.80±0.02*#0.84±0.03*#52.70±4.03*#0.59±0.06*#注：*：与常氧组比较P＜0.01；#：与缺氧12h组比较P＜0.01图1示HepG-2细胞AFPmRNA表达图2示HepG-2细胞ICAM-1mRNA表达1:DNAMarker；2：缺氧24h组；3：缺氧12h组；4：常氧组β-actin(600bp)ICAM-1(377bp)β-actin(600bp)AFP(193bp)2000100075050025010025010020001000750500250100250100图3示流式细胞术测定HepG-2细胞ICAM-1蛋白表达A、B、C分别表示缺氧24、12组和常氧组HepG-2细胞ICAM-1蛋白表达量3讨论AFP基因和白蛋白基因结构相似,是白蛋白基因家族中的一员;有三个增强子,它们可以和各自相应的特定因子结合而激活AFP基因的启动子。甲胎蛋白在胚胎发育和生殖系统肿瘤、肝癌、肝炎等病理状态时升高,与新生细胞或肿瘤等生长旺盛细胞密切相关,是促进肿瘤细胞生长的内源性物质[4]。实验证明：AFP能单独或协同生长因子促进细胞增殖;AFP增强HeLa细胞增殖活性的分子机制是AFP和细胞膜上的受体结合后,首先激发细胞对Ca2+通透性改变,引起cAMP浓度的升高,后者激活PKA,导致细胞内各种蛋白质的磷酸化和/或去磷酸化,促进突变型p53和p21ras蛋白的表达[6]。缺氧应激（5%O2）上调HepG-2细胞AFP基因的表达,可能是缺氧应激下HepG-2细胞增殖活性增强的分子机制之一。人ICAM-1基因(又名CD54基因)长15.5Kb,有7个外显子和6个内含子，定位于染色体19p13.2-13.3区，编码由4个前后排列的免疫球蛋白样区域组成的糖蛋白，在巨噬细胞、内皮细胞等多种细胞中表达，是介导细胞间识别和粘附的重要粘附分子[7]。曲增强等用原位杂交技术研究肝癌及癌旁组织中ICAM-1mRNA的表达,发现侵袭性生长和有转移灶的癌细胞ICAM-1表达要高于非侵袭性生长和无转移灶的癌细胞[8]。缺氧应激（5%O2）上调HepG-2细胞ICAM-1基因的表达,可能是缺氧应激下HepG-2细胞侵袭能力增强的分子机制之一。4参考文献1卢根林,邓勇,樊海宁,等.缺氧应激对HepG-2增殖活性和HIF-1α、MMP-2表达的影响.青海医学院学报,2007,4:485-490.2卢根林,邓勇,樊海宁,等.缺氧应激对缺氧应激对人肝癌细胞粘附、侵袭和迁移能力的影响.第三军医大学学报，2008，721-723.3DavidZ,YevgeniyL,LiL,etal.Hypoxia-induciblefactor1andVEGFupregulateCXCR4inglioblastoma:implicationsforangiogenesisandgliomacellinvasion.LabInvest,2006,12:1221-1232.4徐胜军,胡炳奎,凌志强,等.AFPmRNA监测外周血游离癌细胞预测肝癌微转移的初步评价.浙江实用医学，2003，8（6）333-335.5VassilisGG,PanayotisZ,