酶工程绪论(XXXX)

第一章绪论第一节酶工程的研究内容第二节生物催化第三节国内外酶制剂工业概况第一节研究内容一．概念二．酶工程研究简史三．研究内容酶的新概念：酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）。按照酶的化学组成，酶有两大类别：蛋白类酶（P酶）：主要由蛋白质组成核酸类酶（R酶）：主要由核糖核酸组成一．概念酶学与酶工程（一）酶学(enzymology)：是生物化学的分支学科。研究内容：酶的组成、结构、性质、功能、生物学合成及其调节等方面的基本理论和基本知识。（二）酶工程(enzymeengineering)：指酶的生产和应用的技术过程。酶学理论在工程方面的实际应用。研究内容：酶的生物生产、酶的提取与分离纯化、酶和细胞固定化、酶的分子修饰、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用。酶的生产（enzymeproduction）是指通过各种方法获得人们所需酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。提取分离法生物合成法化学合成法酶的生产方法酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample酶的改性（enzymeimproving）是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。酶的应用（enzymeapplication）是通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。酶的固定化菌种→扩大培养→发酵→发酵酶液→酶的提取→酶成品原料→前处理→杀菌→酶反应器←↓反应液→产品提取→产品酶工程基本过程酶工程研究内容1、酶制剂的大批量生产2、酶制剂的分离、提纯3、酶分子改造与化学修饰，模拟酶、抗体酶等的研究（化学酶工程）（生物酶工程）4、酶与细胞固定化5、酶的非水相催化6、酶的应用性开发⒈酶制剂的生产2.酶制剂的分离、提纯工业用酶制剂一般是从细菌、酵母、植物和动物细胞中生产并且需要分离、提纯。影响其价格的因素，主要是分离、纯化过程，其费用通常占生产成本的50％～70％，甚至高达90％。分离步骤多、耗时长，往往成为制约生产的“瓶颈”。寻求经济适用的分离纯化技术，成为热点。目前已发现和鉴定的酶有8000多种，但大规模生产和应用的商品酶只有数十种。传统酶在工业上受到一些限制：①稳定性②酶的分离纯化工艺复杂，造价高(一）化学酶工程1自然酶的开发2酶的化学修饰3酶的固定化4人工合成酶的研究（二）生物酶工程1酶基因的克隆表达2酶的遗传修饰3酶的遗传设计3.1化学酶工程（1）化学修饰酶可以改善酶的性能，以适用于医药的应用及研究工作的要求。化学修饰酶的功能基：如α-胰凝乳蛋白酶表面的游离氨基修饰成亲水性更强-NHCH2COOH,使酶抗不可逆热失活的稳定性在60℃提高1000倍；大分子修饰：可溶性高分子化合物如肝素、葡聚糖、聚乙二醇可修饰酶蛋白的侧链，提高酶的稳定性，改变酶的一些重要性质。（2）人工模拟酶利用有机化学的方法合成一些比酶简单的非蛋白质分子，可以模拟酶对底物的络合和催化过程，既可达到酶催化的高效性，又可克服酶的不稳定性。酶的模拟工作可分为3个层次：(1)合成有类似酶活性的简单络合物；(2)酶活性中心模拟；(3)整体模拟，即包括微环境在内的整个酶活性部位的化学模拟。目前用于构建模拟酶的这类酶模型分子有环糊精、冠醚、穴醚、笼醚、卟啉、大环番等。利用环糊精已成功地模拟了胰凝乳蛋白酶、核糖核酸酶、转氨酶、碳酸酐酶等。1985年Bender等人成功制备了名为-benzyme的胰凝乳蛋白模拟酶。-环糊精模拟酶催化反应的速率与传统酶近似，但热稳定性与酸碱稳定性大大优于天然酶。OH（3）抗体酶以过渡态类似物作为半抗原，诱发的抗体即与该类似物有着互补的构象，这种抗体与底物结合后，即可诱导底物进入过渡态构象，从而引起催化作用抗体酶的出现为生物学、化学和医学提供具有高度特异性的人工生物催化剂，并可以根据需要获得催化某些不能被酶催化或较难被催化的反应的催化剂。抗体酶的出现，意味着有可能出现简单有效的方法，从而可凭主观愿望来设计蛋白质（人工裁制）3.2生物酶工程酶学与现代分子生物学技术相结合，主要包括：用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶);设计新的酶基因，合成自然界即不曾有的新酶。用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）在表达载体，通过发酵方法大量生产所需要的酶与载体连接克隆目的基因用于医药或工业上的尿激酶原、组织纤溶酶原激活剂、凝乳酶、α-淀粉酶、青霉素G酰化酶等都可用此法大量获得。对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶)通过定点诱变技术，能产生被改造的新酶；可改变酶的催化活性、底物专一性、最适PH;改变含金属酶的氧化还原能力；改变酶的别构调节功能；改变酶对辅酶的要求；提高酶的稳定性例如将枯草杆菌蛋白酶的第99位门冬氨酸及156位谷氨酸替换为赖氨酸后，使这个酶在pH7时的活力提高了1倍，在pH6时活力提高了10倍。例如,将T4溶菌酶的第51位苏氨酸转变成脯氨酸,使酶活力提高了25倍。4、酶与细胞固定化一般酶催化反应是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。酶固定化之后，不仅具有高的催化效率和高度专一性，而且提高了对酸碱和温度的稳定性，增加了酶的使用寿命；反应后易于反应产物分离，减少了产物分离纯化的困难，从而提高产量和质量。因此固定化酶已成为酶应用的主要形式。固定化酶已在工农业、医药、分析、亲和层析、能源开发、环保和理论研究方面得到广泛应用。◆酶在非水相介质中催化反应的研究:在理论上进行了非水介质（包括有机溶剂介质，超临界流体介质，气相介质，离子液介质等）中酶的结构与功能、非水介质中酶的作用机制，非水介质中酶催化作用动力学等方面的研究，初步建立起非水酶学（non-aqueousenzymology）的理论体系。◆非水介质中酶催化作用的应用研究，取得显著成果。5、酶的非水相催化6、酶的应用研究酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。食品工业：β-淀粉酶水解淀粉产生麦芽糖，用来生产高麦芽糖浆（糖果、果脯、饼干、面包等代替饴糖和蔗糖）a-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉，就可以代替蔗糖生产出高果糖浆医用针剂麦芽糖，麦芽糖醇，麦芽糊精等。凝乳酶与奶酪生产啤酒的制作轻工业：酶用于洗涤剂制造----加酶洗衣服在护肤品中添加SOD，清除皮肤表面的超氧自由基可抗衰老蛋白酶用于皮革脱毛胶医药：诊断---可根据体液中酶活性的变化诊断疾病，一般健康人体液中所含的某一种酶的量是恒定在某一范围的，若发生变化则可能得病，如谷丙转氨酶活性升高，可能的肝炎治疗---有些消化药中，往往用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶与淀粉酶、脂肪酶等制成复合制剂，增加疗效二、酶的研究简史1897年，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备的抽提液，并证明不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。酶的研究历史1878年,给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。酶的作用机理及酶的本质做了深入研究，1930年，证实酶是一种蛋白质；80年代初发现了具有催化功能的RNA——核酶，打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域，现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。酶的应用历史1908年,德国的罗姆制得胰酶,用于皮革的软化。1908年,法国的波伊登(Boidin)制备了细菌淀粉酶,应用于纺织品的退浆。1911年,美国的华勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。在50年代以前停留在从微生物，动物或植物中提取酶,加以利用阶段。特点：生产力落后,生产工艺较繁杂,难以进行大规模工业化生产。酶的应用历史1949年，日本采用微生物液体深层培养进行细菌α-淀粉酶的发酵生产，揭开了现代酶制剂工业的序幕，发酵工程技术发展使酶的生产得以大规模发展。50年代以后，生化工程的发展,大多数酶制剂的生产已转向微生物深层发酵的方法。酶的应用越来越广泛。1953年德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂与淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等结合,制成了固定化酶。自然酶在工业应用上受限制的原因：脱离其生理环境后不稳定酶的分离纯化工艺复杂酶制剂成本较高酶工程60年代，固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。出现了“酶工程”来代表有效利用酶的科学技术领域。固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代，70年代已在全世界普遍开展。酶工程1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,主题即是固定化酶，开展了对微生物细胞固定化的研究。1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸。1978年,日本的铃木等固定化细胞生产α-淀粉酶研究成功。80年代，发展了固定化原生质体技术,排除了细胞壁障碍。固定化细胞采用固定化细胞生产蛋白酶、糖化酶、果胶酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等的研究相继取得进展。1986年，我国学者郭勇等采用固定化原生质体生产碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、谷氨酸脱氢酶等的研究相继成功，为胞内酶的连续生产开辟新途径。酶的非水相催化1984年，克里巴诺夫（Klibanov）等进行了有机介质中酶的催化作用的研究，发现脂肪酶在有机介质中不但具有催化作用，而且还具有很高的热稳定性，改变了酶只能在水溶液中进行催化的传统观念。此后，有机介质中酶的催化作用的研究迅速发展。酶分子修饰20世纪80年代以来，酶分子修饰技术发展很快，修饰方法主要有：酶分子主链修饰、酶分子侧链基团修饰、酶分子组成单位置换修饰、酶分子中金属离子置换修饰和物理修饰等。酶分子进化随着易错PCR（error-pronePCR）技术、DNA重排（DNAshuffling）技术、基因家族重排（genefamilyshuffling）技术等体外基因随机突变技术以及各种高通量筛选（high-throughoutscreening）技术的发展，酶定向进化（enzymedirectedevolution）技术已经发展成为改进酶催化特性的强有力手段。酶分子进化酶的定向进化是一种快速有效地改进酶的催化特性（底物特异性、酶活性、稳定性、对映体选择性等）的手段，通过酶的定向进化，有可能获得具有优良特性的酶分子。酶的定向进化技术已经成为酶工程研究的热点。经过100多年的发展，酶工程已经成为生物工程的主要内容。在世界科技和经济的发展中起重要作用。酶工程的主要任务经过预先设计，通过人工操作获得人们所需要的酶，并通过各种方法使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。酶工程的研究概况及发展前景新酶的研究与开发自然酶的开发，自然酶开发的宝藏是极端环境微生物和不可培养微生物核酸类酶的研究与开发抗体酶的研究与开发端粒酶的研究与开