离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

一、实验目的和要求1．学习离子交换层析的基本原理；2．学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3．学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。二、实验内容和原理1．离子交换层析：离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。2.酶活性检测：蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。同时，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。三、实验材料和试剂1．实验材料：蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ。2．实验试剂⑴DEAE-SepharoseFastFlow(弱碱性阴离子交换剂)；⑵20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液；⑶20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3缓冲液(学生自配）；⑷0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5；⑸5%蔗糖溶液；⑹3，5-二硝基水杨酸试剂。四、实验器材与仪器1.高速冷冻离心机；2.层析柱（φ1.0×20㎝）(1支/组）；3.恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1台/组）；4.梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/组）；5.核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）（1台/组）；6.记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）（1台/组）；7.部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）；8.铁架台、夹子（固定层析柱用）（1套/组）；9.－20℃冰箱（保存样品用）；10.微量移液枪200ul、1000ul；11.1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）；12.7ml离心管（留样品Ⅳ用）；13.恒温水浴（100℃）；14.试管、移液管、试管架等。五、操作方法和实验步骤1.样品处理：将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于10ml20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液；4℃12000r/min,离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ）测量总体积(ml数），留取1ml（样品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS-PAGE分析；将其余样品（样品Ⅲ）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力检测）。2.纯化检测仪器连接：将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝），恒流泵(10rpm)（流速0.2～0.6ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（3～4ml/管）等按下图连接并设置好。纯化检测仪器连接示意图：1.50ml20mmol/LTris-HCl，pH7.3缓冲液2.50ml20mmol/LTris-HCl，（1mol/LNaCl）pH7.3缓冲液3.装柱(层析柱规格1×20cm)、平衡：装柱前将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积）20mmol/LTris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE-SepharoseFastFlow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至层析柱上端。注意不能带进气泡，待柱内DEAE-SepharoseFastFlow凝胶沉降并分出水层后，吸去水层，再补加处理好的DEAE-SepharoseFastFlow凝胶；待凝胶自然沉积30min后松开层析柱出口，调节流速1ml/3min；直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约3cm处为止（这时须保持DEAE-SepharoseFastFlow凝胶柱面平整）。用20mmol/LTris-HCl、pH7.3的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。4.加样：停止加入20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意样品顺着柱壁加入，尽可能保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进入胶体。待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度，继续用20mmol/LTris-HCl、pH7.3的缓冲液洗脱。5.洗脱（梯度洗脱法）：待未吸附的杂蛋白洗脱完全后（此时层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定），改用梯度为0-1mol/LNaCl的梯度缓冲液进行洗脱。层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml0.02mol/LTris-HClpH7.3缓冲液和50ml含1mol/LNaCl的0.02ml/LTris-HClpH7.3缓冲液。洗脱流速不变，每3-4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于后续实验，样品－20℃低温保存备用。6.蔗糖酶活力检测:空白对照样品管0.2mol/L乙酸缓冲液，pH=4.50.5ml0.5ml5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml蒸馏水1.0ml0.9ml分离纯化样品溶液/0.1ml50℃水浴10分钟3,5-二硝基水杨酸1.0ml1.0ml100℃水浴5分钟蒸馏水5ml5ml观察颜色收集活力高的蔗糖酶液，测量总体积(ml数)（样品Ⅳ），-20℃保存备用六、实验数据记录和处理1.洗脱曲线：数据：样品Ⅳ总体积15.0ml。2.蔗糖酶活力检测：左起分别为：空白对照；样品管1：7号试管收集的样品；样品管2：9号试管收集的样品；样品管3：11号试管收集的样品。现象：空白对照和样品管1的溶液呈橙黄色，样品管2的溶液呈黄褐色，样品管3的溶液呈棕褐色。