突破MTT法总结及结果分析

基因是能表达而形成有功能产物（蛋白质或RNA）的DNA序列（或RNA）基因不仅包括编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列及位于编码区5’’端上游的非编码序列、内含子和位于编码区下游3’’端的非编码序列基因分为三类：既转录，又翻译：编码蛋白质基因只转录，不翻译：ttRNA、rRNA不转录，不翻译：调控基因、假基因等Denaturation(变性)：本质是双链间氢键的断裂方法：加热、化学试剂现象：OD260增高【增色效应】解离曲线：OD260/TTm：OD260达到最大值的一半时的温度称为DNA的解链温度。Tm与G+C%成正比，一般G+C%每增加1%，Tm增加0..4℃。如G+C%占40%，则Tm为87℃，60%则升高至96℃。Renaturation（复性）：变性的DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，称为DNA复性。Annealliing（热变性）::热变性的DNA经缓慢冷却后复性。退火越慢、温度越高，特异性就越好，否则错配的可能性就越大。影响因素:DNA的序列、DNA浓度、DNA片段大小、温度【Tm–25℃】、溶液的离子浓度。Hybridization（杂交）：DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以形成局部双螺旋DNAReplication（复制）：半保留复制；双向复制；半连续复制条件：模板dNTP（N=AGCT）DNA聚合酶引物DNA突变：突变是某些疾病的发病基础；突变主要有错配、缺失、插入和重排；突变修复包括光修复、切除修复、重组修复和SOS修复。基因表达：将DNA中储存的遗传信息转变为各种有功能的蛋白质（或RNA）的过程基因的有关实验操作1、核酸的分离、纯化破碎细胞【超声波、EDTA、SDS处理】；用蛋白变性剂或蛋白酶去除蛋白质【酚:氯仿:异戊醇抽提】【蛋白酶】；用乙醇【异丙醇】沉淀核酸；用RNase去除残留RNA。2、核酸的定量和纯度判断分光光度法【紫外】：核酸分子在260nm处有特异的紫外吸收峰，吸收强度与核酸浓度成正比；在波长260nm的紫外线下，1个OD..的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ull，单链DNA或RNA浓度为40ug/ull，寡核苷酸浓度为33ug/ull。3、核酸的贮存DNA的贮存：将DNA溶于TE溶液中，贮存于4℃或-70℃。【EDTA可以鳌合金属二价离子，抑制DNA酶的活性，TE的PH值为8，可减少DNA的脱氨反应，-70℃可以保存5年】RNA的贮存：将RNA溶于0..3MNaAc(PH::5..2)或双蒸灭菌水中，贮存于-70℃。RNA长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，-20℃保存，非常安全。4.核酸的电泳分离-琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳的分辨率取决于凝胶的浓度，浓度越高，分辨率越高；反之，则越低；不同构型的DNA分子，其电泳迁移率也不同：构象越紧密，迁移越快；线性DNA分子迁移率的大小与其分子量大小的对数成反比，可以通过与Marker的较来确定其分子量。5、核酸分子杂交核酸分子杂交的基本原理：是用已知的DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知的核酸序列，通过核苷酸间的碱基互补原则相互结合，经显影或显色的方法，将结合的核苷酸序列的位置和大小显示出来。探针（Probe）：能与特定核苷酸序列发生互补结合的带有标记物的已知的核酸片段。探针的种类：基因组DNA(包括人、动物、细菌、病毒等）探针：来源于基因组文库。克隆于载体中取之不尽，相对稳定。cDNA探针：不含内含子和重复序列。RNA探针：与DNA结合牢固，因不存在互补链而使杂交效率更高，可以用RNase处理而降低成本，但不稳定。寡核苷酸探针：15-30bp的寡核苷酸，易于人工合成和修饰，但所带标记物少。探针上必须带有可识别的信号标记，以便跟踪观察与其同源的核酸序列间的杂交反应的位置、大小及杂交信号的强弱。探针的标记：放射性标记物：灵敏度高、不影响酶的活性和碱基配对，缺点是易造成放射性污染。32P35S3H14C125II131II非放射性标记物：无放射污染。生物素：核酸+生物素+亲和素+荧光蛋白【或酶】；地高辛：核酸+地高辛+抗地高辛蛋白+荧光蛋白【或酶】；荧光素：适用于细胞原位杂交和染色体杂交。探针标记的方法：缺口平移标记DNA（NickTranslation）；杂交的种类：Soutthern印迹法（Southernblotting）基因组DNA限制性酶切→凝胶电泳【变性】→转化NC膜→杂交【探针】→结果检测【放射自显影】。Northern印迹法（Northernblotting）Western印迹法（westernblotting）原位杂交、斑点杂交PolymerasePolymeraseChainReaction—PCR基本原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对与模板互补的寡核苷酸链为引物，以dNTP为原料，在DNA聚合酶的作用下，依半保留复制的原理合成新的DNA链并重复这一过程，使DNA片段获得扩增。反应体系：PCR管中依次加入PCRwater、Buffer、Mg2+、dNTP、Priimer1&2、DNAtemplateandDNAPolymerase.过程与结果：Denaturation：90-95℃;Annealling：50-60℃;Extension：72℃RT-PCR:目前从组织或细胞中获取目的基因，以及对基因表达进行定量（半定量）分析的最有效方法。基因组:细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和。基因组DNA序列分为：基因序列和非基因序列；编码序列和非编码序列；单一序列和重复序列。基因组携带着构成和维持生命所必须的所有生物信息。1、病毒基因组结构与功能的特点基因组小，基因数目少：编码序列大于90%，单拷贝基因，基因重叠，相关基因丛集（多顺反子），结构基因不规则等；基因结构多样，生物学性状多变：遗传物质多样（DNA、RNA，单链、双链，环状、线状）；不同病毒基因组大小差别大，组织结构不同，如基因组或基因的连续与不连续。2.原核基因组结构与功能的特点基因组大小居中：基因组大小和基因数量居中，编码序列约占50%，大多为单拷贝，基因极少基因重叠。基因结构稳定、单一：基因组为双链环状DNA，位于类核区，无内含子，操纵子为基本调控单元。有染色体外遗传物质。大肠杆菌基因组1、双链环状，全长4..6×106bp。2、大肠杆菌基因组含有3500个基因。3、几乎都是单拷贝基因。质粒（Plasmid）质粒的概念：细菌细胞内的，染色体外的，共价、闭合、环状DNA分子(covalentclosedcircularDNA，cccDNA))，能在宿主细胞内独立自主复制，并分配到子细胞中，带有某些遗传信息。质粒与宿主的关系：宿主对质粒来说是必需的；质粒可赋予宿主细胞某些生物学形状。如：抗性基因，可以使宿主获得生存优势，与基因工程实验密切相关。质粒的作用：质粒的复制能力强、拷贝数多、转化率高，具有遗传筛选标记，因此，质粒是基因工程的重要载体（vecttor）之一，能把外源基因（目的基因）送到宿主细胞中去克隆扩增或克隆表达。真核基因组1、基因结构单一，基因组庞大，基因数量多双：链线状DNA、两倍体、基因组不连续、多个复制起始点、编码序列≤10%。2、结构基因为断裂基因：真核生物结构基因中，编码序列被非编码序列隔开，称断裂基因或间隔基因(interruptedgene)；编码序列称为外显子(exon)，非编码序列称为内含子(intron)；GT-AG法则：所有内含子的5´端都是GT，而3´端都是AG。3、单顺反子【monocistron】：一个转录单位【结构基因+调控区】只编码一个蛋白质，或一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质。4、基因家族：指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度的同源性，且功能相关的一组基因，也可称为多基因家族。基因超家族【genesuperfamily】：指一组由多基因家族及单基因组成的更大基因家族，结构有一定程度的同源性，但功能并不一定相同。假基因【pseudogene】：指多基因家族中那些不产生基因产物的一类基因，用Ψ表示。一般不能转录或转录后生成无功能的产物。5、重复序列：重复序列与基因组的结构稳定性、组织形式以及基因表达调控有关，与遗传病也有密切关系。除编码ttRNA、rRNA、组蛋白、IIg的基因外，主要为非编码序列。根据重复频率的高低，可分为：高度重复序列【highlyrepetitivesequence】占人类基因组5-15%，重复频率105，长度2-20bp；中度重复序列【middlerepetitivesequence】占人类基因组35%，重复频率10~105，长度300-7000bp；单拷贝序列【uniiquecopysequence】指在整个基因组中仅出现一次或少数几次的序列，占人类基因组60-65%。根据组织形式的不同，可分为：串联重复序列，重复单位串联排列在染色体上，一般没有间隔序列，如卫星DNA【satelliteDNA】(G+C)%不同导致DNA片段密度改变；散在重复序列，重复单位散在分布在染色体上；反向重复序列，序列相同，方向相反，如回文结构、发卡结构。基因组学不是只研究一个基因，而是一组基因；不是只研究基因的结构，还要研究功能是指对所有基因进行基因组作图（遗传图、物理图和转录图）和核苷酸序列分析，从而进行基因定位和基因功能分析的一门学科。在全基因组背景下和整体水平上完成。以分子生物学技术、电子计算机技术和信息网络技术为研究手段。包括结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学、疾病基因组学、药物基因组学和环境基因组学……结构基因组学：以全基因组测序为目标的基因组研究，通过测序、作图等手段，弄清基因组中全部基因的位置和结构，为基因功能的研究奠定基础。目的：完成物理图、遗传图、转录图和序列图。物理图：以已知序列的DNA片段为位标，位点间的实际长度【bp】为图距作图遗传图：以人类基因组中自然存在的遗传标志【多态性】为位标，以遗传学距离【cM（厘摩）】为图距作图。转录图：以表达序列【expressedsequencestags，EST】为位标，又称为“表达序列图。位标又称为序列标志位点（sequencetaggedsites，STSs），即染色体定位明确且可以用PCR扩增的单拷贝序列。功能基因组学：以结构基因组学提供的信息，全面、系统地分析基因组中全部基因的功能。又称为后基因组学，使基因组的研究由静态序列研究转向动态生物学功能研究。基因组学相关技术：1、核酸序列测定双脱氧测序法（Sanger法）建立四个DNA复制反应体系，加入各原料；加入相应ddNTP；聚合酶：Kllenow片段T7DNA聚合酶；PAGE电泳分离核酸；读取结果。2、全基因组鸟枪法拼接序列测定基本步骤：切割DNA片段【限制酶、超声波】；插入测序载体；两端测序；计算机序列拼接；填补缺口本法适用于小基因组测序：流感嗜血杆菌3、单链构象多态性（SSCP）技术原理：单链DNA片段具有独特的空间折叠构象，当碱基发生改变时，会导致单链DNA的空间构象发生改变，通过非变性PAGE电泳，可以敏锐地将其分开。基本过程：PCR扩增靶DNA：扩增产物不宜过长（小于500bp），否则不易形成稳定空间构象；变性、复性：使之形成稳定空间构象；稀释：1::4-1::6，电泳条带更清晰；电泳：非变性PAGE，或使用低浓度变性剂；染色。4、变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）原理：利用梯度变性胶（尿素、甲酰胺）来分离DNA片段。电泳开始时，DNA未变性，迁移率仅与分子大小有关。当电泳至该DNA变性浓度时，DNA变性，电泳速度大大降低。由于不同DNA变性条件不同，从而在凝胶上得以分离。基本过程：PCR扩增；电泳；染色及观察。5、限制性片段长度多态性（RFLP）技术一种限制性内切酶消化不同个体的DNA时，会得到各不相同的限制性片断。当碱基的变化改变了限制酶的识别位点，就会得到不同的片段。通过限制性内切酶酶