竹叶椒化学成分与镇痛抗炎

竹叶椒（ZanthoxylumarmatumDC.）和簕欓（Z.avicenna（Lam.）DC.）的化学成分及竹叶椒镇痛抗炎活性研究郭涛【摘要】：花椒属是芸香科分布最广的一属,主要分布在亚洲、非洲、美洲、大洋洲的热带和亚热带地区。我国有39种,14个变种。在我国民间,竹叶椒(Zanthoxylumarmatum)被用于治疗腹痛、牙痛等；簕欓(Zavicenna)有活血止痛的功效。疼痛是一种复杂的生理心理活动,是临床上最常见的症状之一。镇痛药物在人们的日常生活中使用的非常普遍。文献研究显示花椒属植物中木脂素和生物碱类化合物有抗炎、镇痛方面的活性,因此从花椒属植物中寻找具有镇痛活性的新化合物引起了研究者的广泛关注。第一部分、植物化学研究用常规的柱层析(CC)、制备薄层层析(PTLC)、重结晶等手段对竹叶椒和簕欓的化学成分进行了分离,并用UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、2D-NMR、CD等光谱手段鉴定化合物的结构。竹叶椒的根茎采集于广西南宁,从其乙酸乙酯部位共分离得到了48个化合物,鉴定了其中的41个。包括20个双四氢呋喃木脂素,4个三萜,2个甾体,5个异喹啉类和2个喹啉类生物碱,4个苯的衍生物,2个香豆素,1个脂肪酸和1个烷烃。其中armatumin(Ⅰ-5)和armatunine(Ⅰ-39)为新化合物。去-N-甲基-白屈菜红碱(I-7),isodecaline(Ⅰ-8),羽扇豆醇(I-13),pinoresinol-di-3,3-dimethylallylether(Ⅰ-19),N-nornitidine(Ⅰ-20),methylxanthoxylol(Ⅰ-22),5'-demethoxyepiexcelsin(Ⅰ-23),对羟基苯甲酸(Ⅰ-24),demethoxyaschantin(Ⅰ-25),epiaschantin(Ⅰ-29),piperitol(Ⅰ-30),pinoresinol-3,3-dimethylallylether(Ⅰ-31),6-acetonyldihydrochelery-thrine(Ⅰ-41),这13个化合物为首次分离,其中I-23和I-29为首次从芸香科中分离得到。簕欓的根茎采集于广西南宁,从其乙酸乙酯部位分离到16个化合物,鉴定了其中的9个,它们分别是香豆素(avicennin,Ⅱ-1;Luvangetin,Ⅱ-8;Xanthoxyletin,Ⅱ-9)、甾体(β-谷甾醇,Ⅱ-2)、三萜(α-香树脂醇,Ⅱ-5；β-香树脂醇,Ⅱ-6；羽扇豆醇,Ⅱ-7)、生物碱(去-N-甲基-白屈菜红碱,Ⅱ-3)和苯的衍生物(邻苯二甲酸二异丁酯,Ⅱ-4)。其中Ⅱ-2到Ⅱ-9,这8个化合物是首次从该植物中分离得到。第二部分、HPLC方法鉴定竹叶椒乙酸乙酯部位的主要成分流动相：乙腈—水。洗脱条件：0-20min,30%-50%乙腈；20-35min,50%乙腈；35-50min,50%-90%乙腈；50min-57min,90%乙腈。流速：1ml/min。检测波长：233nm。乙酸乙酯部位主要的峰达到了基线分离,鉴定了其中8个主要色谱峰。它们分别是eudesmin,horsfieldin,(-)-fargesin,kobusin,sesamin,L-asarinin,planispineA和pinoresinol-di-3,3-dimethylallyl。第三部分、抗炎镇痛药理作用研究第一节、体内试验药理活性研究主要采用经典的动物行为学模型,包括醋酸扭体试验、福尔马林试验、热板法和二甲苯致炎法。选择民间长期使用、临床疗效确定的竹叶椒进行研究。对中草药竹叶椒进行活性跟踪,依次对其乙醇提取物,各个溶剂萃取部位,不同剂量的乙酸乙酯部位及其四个流份,以及部分单体化合物的镇痛和抗炎作用展开研究,得到以下几个主要的结果：1)竹叶椒的乙醇粗提物在三种镇痛模型上都表现出了镇痛活性。尤其在醋酸扭体试验和福尔马林试验的第二相,所有被选择的剂量均表现出显著性。2)阿片受体拮抗剂纳洛酮显著的拮抗了竹叶椒粗提物对福尔马林第一相的镇痛作用,并对第二相也有一定的抑制性。3)在竹叶椒各个溶剂萃取部位镇痛活性筛选中,乙酸乙酯部位的镇痛作用最强(P0.001),其它部位也表现出一定的镇痛作用(P0.05)；4)三种所选动物模型中,不同剂量(800,400,200,100mg/kg)的乙酸乙酯部位,均有很好的抗炎和镇痛活性。5)对乙酸乙酯的几个流份进行镇痛研究,随着极性增大其镇痛作用呈现逐渐减弱的趋势。相同剂量下,乙酸乙酯各个流份对小鼠扭体次数的抑制率要弱于总乙酸乙酯部位。6)在醋酸扭体动物试验中,芝麻素在80mg/kg,去-N-甲基-白屈菜红碱在20、40mg/kg时表现出显著的镇痛效果。在小鼠耳肿胀试验中,(-)-fargesin在80mg/kg、(-)-yangambin在30mg/kg时表现出显著的抗炎作用。根据以上研究结果,得出如下结论：1)竹叶椒镇痛作用机制主要是抗炎镇痛作用,阿片受体也有部分的参与。2)竹叶椒的镇痛作用可能是多种成分协同作用的结果。3)结合已有的文献,生物碱和木脂素类化合物可能是竹叶椒镇痛作用的主要活性成分；木脂素类化合物是其抗炎作用主要活性成分。4)本研究得到了镇痛活性成分芝麻素和去-N-甲基-白屈菜红碱,以及抗炎活性成分(-)-fargesin和(-)-yangambin。在炎症发生时,巨噬细胞通过释放前炎性因子(TNF-α,IL-6),以及炎症介质(NO,PGE2)而积极参与炎症反应过程。TNF-α和IL-6是炎症中的关键因子,NO和PGE2的过度生成在炎性生理反应过程中也发挥着重要作用。本文中,采用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7建立炎症模型,来研究竹叶椒的抗炎机制。主要得到以下主要的结果：1)芝麻素、L-细辛脂素、(-)-fargesin、pinoresinol-di-3,3-dimethylallylether、去-N-甲基-白屈菜红碱、木兰碱都对NO的生成在不同程度上有抑制作用。2)L-细辛脂素和木兰碱在100μM时对Raw64.7诱导的IL-6的产生有显著的抑制作用。3)芝麻素对LPS诱导的TNF-α的生成有抑制作用。4)芝麻素、L-细辛脂素、(-)-fargesin、pinoresinol-di-3,3-dimethylallylether、去-N-甲基-白屈菜红碱、木兰碱都在不同浓度上对PGE2的生成有显著的抑制作用。竹叶椒抗炎的机制涉及对前炎症细胞因子(TNF-α、IL-6)、炎症介质(NO、PGE2)释放的抑制。今后我们将对分离得到的主要化合物(尤其是木质素和生物碱类成分)进行制备。继续通过体内试验来筛选活性成分,并对主要活性成分通过体外试验进行机制研究。以上竹叶椒和筋模化学成分及竹叶椒药理活性的研究结果为花椒属植物的分类、鉴定提供参考,也为进一步开发利用花椒属药用植物资源提供科学依据。【关键词】：竹叶椒簕欓抗炎镇痛木脂素生物碱【学位授予单位】：复旦大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：R284【目录】：摘要7-10ABSTRACT10-14前言14-16第一章竹叶椒抗炎镇痛作用研究16-351.材料与方法17-181.1.植物材料17-181.1.1.乙醇提取物171.1.2.各萃取相的制备171.1.3.乙酸乙酯部位各流份的制备17-181.1.4.单体化合物的制备181.2.试药181.3.实验动物182.药理试验18-192.1.镇痛试验18-192.2.抗炎试验192.3.数据分析193.药理实验结果19-293.1.镇痛植物筛选20-213.2.竹叶椒粗提物镇痛的作用21-233.2.1.醋酸扭体试验21-223.2.2.福尔马林试验22-233.2.3.热板法233.3.不同溶剂萃取部位的镇痛作用23-243.4.乙酸乙酯部位的镇痛抗炎的作用24-263.4.1.醋酸扭体试验24-253.4.2.福尔马林试验25-263.4.3.抗炎试验263.5.乙酸乙酯部位四个馏分的的镇痛的作用26-273.6.单体化合物的镇痛抗炎作用27-293.6.1.单体化合物在醋酸扭体试验中的镇痛作用27-293.6.2.单体化合物在耳肿胀试验中的抗炎作用294.讨论29-334.1.粗提物的镇痛作用30-314.2.各个溶剂萃取部位的镇痛作用314.3.乙酸乙酯部位镇痛抗炎作用31-324.4.乙酸乙酯各个馏分的镇痛作用324.5.单体化合物的镇痛抗炎作用32-33本章小结33-34参考文献34-35第二章化学成分研究35-64第一节、竹叶椒化学成分研究35-551.结果与讨论35-531.1.新化合物的结构解析35-401.2.化合物的主要理化数据40-532.实验材料、仪器和化学试剂53-542.1.供试材料532.2.仪器532.3.化学试剂53-543.提取分离54-55第二节、簕欓化学成分研究55-591.化合物的主要理化数据55-582.实验材料、仪器和化学试剂58-592.1.供试材料582.2.仪器与化学试剂582.3.提取分离58-59本章小结59-60参考文献60-64第三章竹叶椒乙酸乙酯部位主要成分HPLC鉴定64-671.仪器与材料642.样品及对照品的处理642.1.样品642.2.对照品的处理643.色谱条件644.实验结果与讨论64-66本章小结66参考文献66-67第四章、体外抗炎作用机制初步研究67-851.试验材料67-681.1细胞系671.2细胞培养耗材67-681.3试剂及药品681.4试剂盒681.5主要仪器682.试验方法68-722.1细胞复苏与培养682.2细胞冻存68-692.3MTT试验692.3.1基本原理692.3.2试验方法692.4上清的收集69-702.5NO的释放量70-712.5.1基本原理702.5.2NO的释放量的测定70-712.6前细胞因子释放量的测定712.6.1基本原理712.6.2测定及操作要点712.7PGE2的测定71-722.7.1基本原理712.7.2测定及操作要点71-723.数据分析724.试验结果与分析72-824.1RAW264.7细胞的形态72-734.2药物细胞毒性的检测73-744.3NO的测定74-764.4IL-6测定76-784.5TNF-α的测定78-804.6PGE_2的测定80-825.讨论82-84本章小结84参考文献84-85总结与展望85-86一、总结85二、展望85-86花椒属化学成分及药理研究进展(文献综述)86-127参考文献117-127致谢127-128在校期间已发表的论文128-129附图目录129-130附图130-146花椒生物碱成分分离、感官评定及药理作用研究关荣琴【摘要】：花椒(Zanthoxylumbungeanum)属芸香科(Rutaceae)植物,是我国一种传统药食两用原料。生物碱具有抗炎止痒、镇痛杀菌和抗肿瘤等多种生理活性。花椒中生物碱含量丰富,但国内外对其研究较少。本文对花椒生物碱的测定方法进行了研究,采用溶剂浸提法提取花椒生物碱,优化提取工艺后对其进行分离纯化、感官评定和活性研究。试验主要内容如下：选用乙醇作为溶剂,先进行单因素试验,再通过正交试验设计方法,以总生物的得率为考察指标,考察温度、提取时间、乙醇浓度、pH对花椒生物碱的得率的影响。结果显示各因素对生物碱提取得率的影响程度由大到小依次为：乙醇浓度pH值提取温度提取时间,最佳提取工艺条件为：乙醇浓度70%,pH值为3,提取温度60℃,料液比1：20,提取提取时间3h,总生物碱的平均得率为0.8898%。研究大孔树脂纯化花椒总生物碱的条件。利用NKA-9大孔树脂吸附纯化花椒生物碱,通过薄层色谱法和紫外分光光度法鉴定生物碱