第2章基因工程.

第二章基因工程第一节基因工程概况一、基因工程的含义通过转基因技术定向改造生物体。基因工程定义：将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译的操作，也称为重组DNA技术。二基因工程研究的理论依据1.不同基因具有相同的物质基础所有的基因含有特定核苷酸序列的DNA片段；2基因是可以切割的3基因是可以转移的基因可以跨越物种界限进行转移、重组。4多肽与基因之间存在对应关系基因mRNA多肽链转录翻译5遗传密码是通用的6基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代转移的DNA可以同生物内源的DNA一样进行复制、传代，从而获得稳定的转基因生物新品系。目的基因的获得制备载体DNA体外重组重组DNA导入受体及扩增筛选转基因细胞检测转基因细胞中的目的基因目的基因的表达三、基因工程主要研究内容及主要操作流程：四.基因工程突出的优点:打破了常规育种难以突破的物种之间的界限可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行相互重组和转移可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组和转移可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组和转移第二节DNA重组自然发生的DNA重组减数分裂过程中发生的非姊妹染色单体间的重组跳跃基因（转座子）体外DNA重组定向改造生物体DNA是主要的遗传物质一DNA的一般性质1.DNA的组成结构DNA的组成（脱氧核糖、碱基、磷酸）DNA的结构（一级结构、二级结构）变性、复性等2.DNA的功能DNA的复制（复制起始位点ori），DNA编码RNA或多肽链转录启动子、终止子、转录起始点、转录区内含子、外显子、起始密码子、终止密码子等二获得目的DNA片段的主要途径（一）.限制性内切核酸酶和DNA片段化1.限制性内切核酸酶是以环状或线形DNA为底物，能识别DNA中特殊的核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有5′-P磷酸基团和3′-OH羟基的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。（1）定义：I型、II型、III型（2）.分类属名+种名+菌株（或型）+修饰体系类型例：EcoRⅠ（大肠杆菌：Escherichiacoli）HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ（流感嗜血杆菌：（Haemophilusinfluenzae）（3）.命名2.限制性内切核酸酶的识别序列a.识别特定的核苷酸序列，长度通常为4-8个核苷酸；b.在DNA链上呈连续分布，或间断分布；c.DNA序列呈回文结构。识别序列：指限制性内切核酸酶在双链DNA上能够识别的脱氧核苷酸序列识别序列的主要特点：Sau3A识别:GATC，HindⅢ识别:AAGCTT,NotI识别:GCGGCCGC，SfiI识别：GGCCNNNNNGGCC如GATC即指5′-GATC-3′识别序列的写法：5’-3’；基因工程中常用的工具酶：同裂酶同裂酶：指来源不同但有相同识别序列的限制性内切酶BamHIBstI5′-GGATCC-3′具有不同的酶切位点或相同的酶切位点EcoRI：5′-GAATTC-3′3′-CTTAAG-5′5′-G3′-CTTAAppAATTC-3′G-5′3限制性内切核酸酶的酶切位点平切：平末端切割方式：平切、错切如HaeIII:ACGTTGCA5′3′3′5′ACTGGTCA5′3′5′3′3′5′3′5′用HaeIII处理错切：粘性末端（a）5′突出粘末端如EcoRI：用EcoRI处理GAATTCCTTAAG5′3′3′5′5′3′CTTAA3′GAATTC3′5′3′5′G5′粘性末端：DNA双链在不同位置断开，产生带有若干个核苷酸单链尾巴的片段末端。（b）3′端突出粘末端CTGCAGGACGTC5′3′3′5′用PstI处理ACGTC3′5′5′5′CTGCA5′3′3′GG3′如PstI:同尾酶同尾酶:虽然识别序列不同，但切割DNA分子产生的DNA片段具有相同的粘性末端的限制性内切酶SalI:5′-GTCGAC-3′XhoI:5′-CTCGAG-3′5′-TCGA-3′5′-P；3′-OH4.限制性内切核酸酶反应系统底物DNAxuL10X缓冲液3uL酶yuL无菌水(30-3-x-y)uL设30ul的反应体系：30uL37℃1-5小时5.用限制性内切核酸酶酶切DNA的方法(1)单酶切：即用一种酶对DNA进行切割P130112kbEcoRI(A)EcoRI(B)2kbEcoRI10kb2kbxyzu单酶切结果：DNA片段的两末端相同。(2)双酶切：用两种不同的酶切割同一种DNA分子5’-GAATTCAAGCTTTAGGGCCATGCATACGCGTCGAC-3’3’-CTTAAGTTCGAAATCCCGGTACGTATGCGCAGCTG-5’EcoRI,SalI5’-AATTCAAGCTTTAGGGCCATGCATACGCG-3’3’-GTTCGAAATCCCGGTACGTATGCGCAGCT-5’双酶切结果：DNA片段的两个黏性末端不同（同尾酶除外）3.部分酶切（不完全酶切）HindIIIEcoRIEcoRIEcoRIHindIIIcbda目的片段（2.0kb）a.4.0kbb.1.5kbc.1.0kbd.0.5kb(A)(B)—7.0kb6.0kb4.5kb4.0kb3.0kb2.5kb2.0kb1.5kb1.0kb0.5kb+4.0kb1.5kb1.0kb0.5kb(A)EcoRI完全酶切片段电泳图谱(B)EcoRI部分酶切片段电泳图谱影响限制酶活性因素：(1)DNA样品的纯度蛋白质、苯酚，氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1ug的DNA用10U酶加大反应体积延长反应时间(2)DNA样品的甲基化程度(3)核酸内切酶缓冲液的性质（二）.特异性DNA片段的PCR扩增PCR(PolymeraseChainReaction):一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应。1.PCR基本原理DNA的体外复制聚合酶链式反应高温变性:90-95℃低温退火:37-60℃适温延伸:70-75℃反应过程：5’3’3’5’变性、退火、延伸循环n次一次循环两次循环变性5’3’3’5’退火5’5’3’3’5’3’延伸5’3’3’5’5’3’n次循环后双链DNA在理论上的最高值为2n2.PCR反应体系10缓冲液dNTP一对引物DNA模板DNA聚合酶无菌水（补足体系用）A.TaqDNA聚合酶以单链DNA为模板，以引物为起点，按5’3’方向合成新生互补链无3’5’外切酶活性耐高温（95C）最适合成DNA温度为72CB.引物引物长度退火5’5’3’3’5’3’3’5’变性5’3’3’5’防止一对引物内及引物之间同源性GC含量和Tm值Tm=2（A+T）+4（G+C）3.PCR产物的检测4.PCR特点前提条件：已知基因序列或两侧序列能使特定DNA区段得到迅速大量的扩增5.PCR法引入酶切位点5’3’3’5’5’-GGGAATTC引物1CTTAAGGG-5’引物25’3’3’5’5’3’3’3’5’-GGGAATTCCTTAAGGG-5’5’3’CTTAAGGG-5’引物25’-GGGAATTC引物13’5’-GGGAATTCCTTAAGGG-5’3’CTTAAGGG-5’GAATTCCC-3’CTTAAGGG-5’3’3’5’-GGGAATTC3’-CCCTTAAG5’-GGGAATTC•引入EcoRⅠ位点(GAATTC)5’-GGGAATTCCTTAAGGG-5’CTTAAGGG-5’3’-CCCTTAAGGAATTCCC-3’5’-GGGAATTCCTTAAGGG-5’GAATTCCC-3’CTTAAGGG-5’3’3’5’-GGGAATTC3’-CCCTTAAG5’-GGGAATTCCTTAAGGG-5’3’-CCCTTAAGGAATTCGG-3’5’-GGGAATTCCTTAAGGG-5’3’-CCCTTAAGGAATTCGG-3’5’-GGGAATTC打算在细菌中表达一种稀有的人类蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白质。下图是编码该蛋白的核苷酸序列。根据现有条件请先写出由该基因转录的部分mRNA序列；再设计一对PCR引物，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因序列。5’-ATGGCTACTCGTCGCGCTGCTAAACTTGCTGCAAGTCTCTCTAAGTAG-3’5’-AUGGCUACUCGUCGCGCUGCUAAACUUGCUGCAAGUCUCUCUAAGUAG-3’5’-ATGGCTACTCGTCGCGCTGCTAAACTTGCTGCAAGTCTCTCTAAGTAG-3’3’-TACCGATGAGCAGCGCGACGATTTGAACGACGTTCAGAGAGATTCATC-5’5’ATGGCTACTCGTCGCGCTGCGACGTTCAGAGAGATTCATC5’引物1：5’ATGGCTACTCGTCGCGCTGC3’引物2：5’CTACTTAGAGAGACTTGCAG3’5’-ATGGCTACTCGTCGCGCTGCTAAACTTGCTGCAAGTCTCTCTAAGTAG-3’3’-TACCGATGAGCAGCGCGACGATTTGAACGACGTTCAGAGAGATTCATC-5’5’ATGGCTACTCGTCGCGCTGCGACGTTCAGAGAGATTCATC5’为了便于以后对该基因进行酶切和连接等操作，打算在被克隆的该基因两端引入EcoRI限制酶酶切位点。EcoRI酶切位点为GAATTC，要求添加3个保护碱基。引物1：5’GGGGAATTCATGGCTACTCGTCGCGCTGC引物2：5’GGGGAATTCCTACTTAGAGAGACTTGCAG(三)DNA片段的化学合成1.合成引物PCR引物测序引物合成cDNA的引物mRNA:……GCAUAACCGGGUUAGCCCUUAAAAAAAAAAAA…………TTTTTTTTTTTTT第二节DNA重组二获得目的DNA片段的主要途径2.合成DNA寡核苷酸连杆寡核苷酸连杆（linker）：指预先设计，化学合成的寡核苷酸片段8-12bp，以中线为轴两侧互补对称要求：含有一种或几种限制性内切核苷酸的识别序列衔接头：两端具有一种或两种限制性内切核酸酶酶切产生黏性末端的DNA连杆3.合成基因片段直接合成基因的DNA序列，是获得目的基因的途径之一三DNA片段的连接(一).DNA连接酶(DNAligase）定义：能催化两个DNA片段末端之间－P磷酸基团和－OH基团形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶。两种DNA连接酶E.coliDNA连接酶：T4DNA连接酶：粘末端DNA分子粘末端DNA分子平末端DNA分子1.DNA连接酶2.DNA连接酶的连接作用及特点连接酶无活性5’-POH-3’连接酶3.影响连接反应的主要因素（1）温度及时间；（2）连接酶的用量；（3）DNA链的长度。4用于基因工程中的主要修饰酶(1).DNA聚合酶；a.依赖于DNA的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow聚合酶T4DNA聚合酶T7DNA聚合酶TaqDNA聚合酶DNAnDNAn+1DNA聚合酶模板DNA、dNTP等b反转录酶，即依赖于RNA的DNA聚合酶两种类型鼠白血病病毒(M-MuLV)禽成髓细胞瘤病毒（AMV)RNAcDNA反转录酶dNTPc末端转移酶：DNA平末端加同聚尾成粘末端从3’OH末端无模板合成DNA(2).RNA聚合酶：SP6、T7、T3双链DNARNA(3).T4噬菌体多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基转移到DNA或RNA片段的5’末端5’-OH末端加磷反应SP6、T7、T3RNA聚合酶NTP(4).碱性磷酸酶细菌磷酸酶（BAP)小牛肠碱性磷酸酶（CIP)5´p-DNA或5´p-RNA5´OH-DNA或5´OH-RNA碱性磷酸酶除去5’磷酸，阻止自身环化降解双链核酸分子内的单链区5.S1核酸酶S1cDNA第一链cDNA第二链其它的一些工具酶:绿豆核酸酶BAL31核酸酶脱