第2章基因组学.

遗传作图基本概念1.遗传作图定义采用遗传学分析方法将基因或其他DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。2.遗传作图的基本原理随机的染色体上两个任意基因座越远，它们越容易被染色体断裂所分离。3.遗传图距的单位厘摩（cM）:每单位厘摩为1％交换率。交换率（交换值、重组频率）=减数分裂的重组产物/减数分裂的总产物4.遗传作图的主要方法杂交实验、家系分析2、物理作图:应用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置物理图的距离:依作图方法而异,辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR);限制性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对(bp)分辨率低100kb理想的标记密度，但是当时的结果是只能到2-5Mb覆盖面较低重组时间发生少的区域，高密度的连锁图难以完成分子标记的排列有时会出错：环境因素或者取样误差，导致的非随机的群体组成。共同之处：确定基因或分子标记在染色体上的排列位置。基因组测序策略有了高密度的基因组图谱，就可以开始全基因组测序了测序的技术飞速发展，全自动化测序的策略有两个：鸟枪法克隆重叠群法鸟枪法（shotgunsequencing）鸟枪法的优缺点优点：不需要高密度的图谱速度快、简单、成本低缺点：拼接组装困难，尤其在重复序列多的区域主要用于重复序列少、相对简单的原核生物基因组克隆重叠群法（clonecontig）将基因组DNA切割长度为0.1Mb－1Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列再装配、连接成连续的DNA分子。这是一种自上而下（uptodown）的测序策略clone-by-clonemethod两种基因组测序策略TheE.coligenome1.基因标记孟德尔—肉眼→豌豆植株高矮、豌豆颜色等摩尔根—显微镜、肉眼→果蝇躯体颜色、翅膀形状等生化表型→细菌、酵母遗传学研究；人类中如血型系列（ABO）分析、血清蛋白和免疫蛋白遗传作图标记基因标记的缺点高等生物，如脊椎动物和显花植物等，可用作标记的基因十分有限，许多性状都涉及多基因；高等生物基因组中存在大量的基因间隔区，纯粹用基因作为标记将在遗传图谱中留下大片的无标记区段；只有部分基因其等位基因成员可以通过常规试验予以区分，因而产生的遗传图是不完整的，必需寻找其他有效的标记；2.DNA分子标记2.1DNA分子标记作图的优点:不以表型为参照直接检测个体基因型组成具有共显性的特点2.2分子标记用于基因定位的发展史基因定位最早采用的方法就是连锁分析。通过基因与DNA标记之间的重组率来估计基因的位置。可用于连锁分析的DNA标志是基因定位的基础，DNA标记越多，杂合性越强，基因定位就越方便。DNA标记的选择经历了从RFLP-STR－SNP等发展过程。PIC(polymorphicformationcontent)多态性信息量:某一标记在群体中出现多态性的频率。RFLP-限制性片段长度多态性STR-简单串联重复1-6个核苷酸SNP-单核苷酸多态性RFLP,多态性不够高，杂合性（PIC）平均达到0.3，而且在染色体上分布不均匀，难以将一些罕见的基因进行定位；对多基因病的定位也难以奏效。STR位点已经达到8000个，平均100kb－200kb有一个STR位点，杂合性（PIC）平均达到0.7,这已经使得连锁分析的功能发挥到了极限。SNP位点已经达到数十万个，平均1000bp有一个，估计1700万个(40个人筛选结果）。(简单串联重复序列,STRs,simpletendemrepeats)2.3分子标记RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,限制性片段长度多态性)RFLP的特征:♪处于染色体上的位置相对固定;♪同一亲本及其子代相同位点上的多态性片段特征不变;♪同一凝胶电泳可显示不同多态性片段,具有共显性特点;人类基因组中有105个RFLP位点，每一位点只有两个等位基因。DNA序列能或不能被某一酶酶切，相当于一对等位基因的差异。如有两个DNA分子（一对染色体），一个具有某一种酶的酶切位点，而另一个没有这个位点，酶切后形成的DNA片段长度就有差异，即多态性。可将RFLP作为标记，定位在基因组中某一位置上。人类基因组中有105个RFLP位点，每一位点只有两个等位基因。RFLP分析SSLPs(Simplesequencelengthpolymorphisms,简单序列长度多态性)♪SSLP产生重复序列的可变排列,同一位点重复次数不同,表现DNA序列长度变化;♪与RFLP不同,具有多等位性;♪小卫星(minisatellite)和微卫星(microsatellite)序列都可用于遗传作图,但微卫星更普遍。这种重复序列的重复单位很短，常常只有2个、3个或4个核苷酸如一条染色体TCTGAGAGAGACGC另一染色体TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就构成了多态性。SSR，任何两个人的微卫星组合都不同，可以用来编制遗传档案SNP(singlenucleotidepolymorphisms,单核苷酸多态性)1996年，Lander报道了SNP，制备第三代遗传连锁图的遗传标记。♪基因组中单个核苷酸的突变称为点突变;♪理论上每个单核苷酸位置最多只有4种形式,但某些群体特定的单核苷酸位置只有2个或3个SNP,这些位点称为双等位或三等位;不同人群仅有140万个核苷酸差异；人基因组SNP与疾病的关系，及药物遗传学。人基因组SNP有1000万个，在基因内部是20万个，基因外部是其10倍♪在基因组编码顺序中，SNP大多位于密码子的摇摆位置，表现为基因沉默而被大量保留下来;♪大多数SNP所在的位置不能被限制酶识别，必须采取测序或寡核苷酸杂交检测;♪SNP在基因组中的数量极大，二倍体细胞中每个SNP最多只有2种等位型。孟德尔遗传学简介等位基因随机分离定律独立遗传定律完全连锁不完全连锁不完全显性共显性遗传作图的方法1865年不完全显性杂合子表现为2个纯合子的中间表型共显性：杂合子同时出现2个等位基因的表型孟德尔第一定律等位基因随机分离(TheLawofSegregation)♀♂×AAaaAaF1ParentsF2AAaaAa1:2:1A:a=1:1孟德尔第二定律独立分配定律(thelawofindependentassortment)♀♂×F1ParentsF2AaBbABAbaBab25%25%25%25%AB(25%)Ab(25%)aB(25%)Ab(25%)AABBAABbAaBBAaBbAABbAAbbAaBbAabbAaBBAaBbaaBBaaBbAaBbAabbaaBbaabbA:a=1:1B:b=1:1AABBaabb连锁遗传定律♀♂×F1ParentsF2AaBbABAb*aB*ab50%0%0%50%AB(50%)Ab(0%)aB(0%)ab(50%)AABB--AaBb--------AaBb--aabbAABBaabb*完全连锁ABAbaBab(25)(25)(25)(25)(50)(0)(0)(50)(48)(2)(2)(48)配子类型(%)独立遗传孟德尔第二定律完全连锁不完全连锁连锁遗传定律根据重组率计算遗传距离2.连锁分析连锁发生的时期减数分裂Ⅰ期,同源染色体复制后不分离→双价体→重组重组(recombination)或交换(crossing-over):在双价体中,并列的同源染色体臂发生机械断裂,彼此交换DNA区段,这一过程被称为交换或重组.连锁基因之间的交换重组率绘制遗传图重组率为测量基因之间相对距离的尺度.果蝇连锁图♪近端粒区和远着丝粒区有较高的重组率;如老鼠主要组织兼容性复合座位(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)含有一组控制免疫反应的基因，其中一个区段的重组率高于平均数数百倍.遗传图的偏离重组热点(recombinationhotspot)：染色体的某些位点之间比其他位点之间有更高的交换率.遗传图的偏离重组热点区域的特点：均发生在基因Ebeta的第二个内含子上，长度4.3kb，检测到9/11的核苷酸共有序列，5’–TGGAAATCCCC-3’，♪性别之间也会表现重组率的差异♪同一染色体发生多起交换的现象当多起交换发生在2个基因之间时，会产生距离减少的假象。性别特异性的重组热点，女性的长于男性最初的两个性别符号来自于天文符号。1751年，卡尔·林奈最早使用它们来表示植物的性别。[1]上来自火星符号，表示男性或其他雄性生物。下来自金星符号，表示女性或其他雌性生物。3.不同模式生物的连锁分析连锁分析的三大范畴:♪有性杂交实验♪系谱分析♪DNA转移有性杂交实验果蝇、老鼠、玉米、水稻♪系谱分析人类、单仔生殖的大生物，多年生木本♪DNA转移不发生减数分裂的生物，病毒、细菌3.1杂交实验的连锁分析选择已知基因型的亲本获得交配的子代设计杂交方案分析其表型及基因型两点杂交RFLP连锁图♪RFLP作图的程序与经典遗传作图类似,只是统计性状改为DNA分子标记程序：选择已知基因型的亲本→设计杂交方案→获得交配的子代→分析其DNA分子标记♪共分离:在有性繁殖的后代,假如基因附近有一紧密连锁的分子标记,在细胞减数分裂时分子标记与基因之间由于相距太近很少有机会发生交换，那么这种分子标记与连锁的基因有最大的可能同时出现在同一个个体中，这种现象被称为共分离♪图位克隆:从分子标记连锁图中找到与靶基因位于同一连锁群的分子标记,然后再从同一连锁群的分子标记中检测与靶基因接近的分子标记,依次渐进,直至获得最接近基因座的标记为止.3.2系谱分析作图人类样品有限，借助统计学方法对获得的数据进行可信度检验，常用的程度为lod值评价。lod值是基因连锁可能性的对数，用于初步研究的2个基因是否位于同一条染色体上，或者说可以回答2个基因是否连锁。3.3细菌遗传作图细菌遗传作图面临的困难:♪细菌是单倍体♪细菌不发生减数分裂感染(transduction,转导):以噬菌体为媒介，将长度可达50Kb的DNA片段从供体细胞转移到受体细胞。转化(transformation)：供体细胞释放的一段DNA（通常小于50Kb）,经受体细胞摄取后整合到基因组中，可借助抗性培养基筛选重组克隆。接合转移：两个细菌机械接触，其中一细菌（供体）将DNA转移到另一细菌中。供体DNA分子转移后，必须与受体细胞DNA发生双交换才能整合到受体细胞染色体中，否则，转移的DNA将随受体细胞分裂而丢失，除质粒附加体转移例外。人类遗传图1987393个RFLP和10个多态性DNA标记，平均密度10Mb19945800个标记（4000个SSLP），平均密度0.7Mb1998STR8000多个380kb物理间隔水稻遗传图1994726个分子标记，平均密度4.0cM1998STR2275个分子标记，平均间隔0.66cM