第3章植物细胞工程的基本理论.

第3章植物组织与细胞培养的基本原理第一节植物细胞的全能性第二节植物细胞的分化第三节器官发生与体细胞胚胎发生第四节人工种子外植体（explant)：指从植物体上分离出来，用于离体培养的活的各类组织、器官或细胞。初代培养(primaryculture)：对植物外植体进行的第一次离体培养。继代培养(subculture)：对外植体的初代培养物或增殖培养物重新切割、筛选，接种于新鲜培养基中，进行连续多代移植培养的过程。再生植株（regeneratedplant）：经过离体培养形成的植株。第一节植物细胞的全能性一、植物细胞全能性的建立基础1、细胞学说（celltheory）细胞学说是植物细胞工程研究的思想基础。1838年德国植物学家施莱登（Schleiden）和动物学家施望（Schwann）提出细胞学说。细胞学说的基本论点：细胞是生物结构、功能和发育的基本单位。细胞是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体。如果具有与有机体内相同的条件，每个细胞都可以独立生活和发展。2、植物的再生现象：不经过雌、雄配子的结合，由母体植株的一部分重新形成其它器官或完整植株的现象。植物的再生现象对植物细胞全能性的发现起着极其重要的作用。细胞学说的建立与植物再生现象为植物细胞全能性的提出提供了理论基础。1902年，Haberlandt,首次提出了植物细胞全能性的观点：认为高等植物的体细胞可以不断分割，直至单个细胞。如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么，可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个体。二、植物细胞全能性学说的定义1、植物细胞全能性的概念及其发展1943年，美国科学家White正式提出植物细胞具有全能性(totipotent)的学说,给植物细胞全能性一个定义：认为每个植物细胞都具有该物种的全部遗传信息，在适宜条件下具有发育成胚胎和完整植株的能力。植物细胞的全能性(plantcelltotipotency)是指每个具有完整细胞核的植物活细胞，含有该植物的全套遗传信息，具有在适宜条件下发育成完整植株的潜在能力。1958年，Steward培养来自胡萝卜根的悬浮细胞，并成功地诱导单个的悬浮细胞发育为成熟的胚胎，完全证明了Haberlandt提出的细胞全能性学说。至今，已经能够在一千多种植物上，从各种类型的组织和细胞，甚至是原生质体，诱导出胚胎和完整植株。★细胞全能性仅是一种能力或可能性，不是所有具有全能性的细胞都能进行全能性的表达。2、植物细胞全能性的含义★每个植物生活细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息。★每个植物生活细胞均具有发育成完整植株的潜在能力。自然条件下：invivo一般只有胚性细胞（embryoniccell)或分化程度不高的细胞才可具备发育为胚胎或植株的全能性。类似于动物的胚胎干细胞（embryonicstemcells)三、植物细胞全能性的实现主要包括三类细胞：植物的合子及早期胚胎细胞；植物的顶端分生细胞；一些成熟器官和组织中遗留的一些胚性细胞（胚囊中细胞，珠心组织，叶柄或叶肉薄壁细胞，表皮细胞。）对于已经成熟的分化细胞，可以在离体条件下实现细胞全能性，但有极少数类型的细胞完全失去分裂的能力，即终端分化细胞：细胞核已经开始解体的筛管和木质部；细胞壁超过2μm的纤维细胞、管胞细胞；气孔保卫细胞、腺毛细胞等。离体条件下invitro三、植物细胞全能性的实现1、植物细胞全能性表达的条件2、实现植物细胞全能性的途径P37细胞全能性是细胞分化的理论基础，而细胞分化是细胞全能性的具体表现。植物细胞全能性表达的条件（1）离体（2）植物生长调节物质的是必备的关键物质（3）供给植物生长所必须的营养物质和环境条件一个已分化的细胞通过脱分化向分生状态回复可能达到的程度，取决于它已有的分化程度。离体条件下植物细胞全能性的实现途径离体培养条件下，植物体细胞、性细胞、原生质体、经过遗传信息修饰的细胞都可能实现细胞全能性。大量事实证明，植物细胞具有全能性。离体培养条件下，一个已经分化的成熟细胞要表现其全能性，先要通过脱分化，经过细胞分裂形成愈伤组织，经过再分化形成完整植株。脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。第二节植物细胞的分化一、细胞的脱分化和再分化脱分化（dedifferentiation）：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。愈伤组织（callus）：脱分化后的细胞，经过分裂形成无特定结构和功能的松散的细胞团，具有再分化的能力。再分化（Redifferentiation）：脱分化后的分生细胞在特定的条件下，重新回复细胞分化能力，形成各种不同类型的细胞，并经历器官发生或胚胎发生，进一步发育成完整植物体的过程。高等植物细胞脱分化和再分化示意图成熟细胞细胞分生细胞多细胞团形态建成完整植株细胞细胞脱分化分裂再分化脱分化再分化不同类型细胞实现全能性的能力营养生长点细胞形成层细胞薄壁细胞厚壁细胞特化细胞高低二、细胞脱分化和再分化的过程1、诱导期（Induction）2、分裂期（Celldivision）3、分化期（Differentiation）愈伤组织的形成经历三个时期。细胞分裂的准备期，即脱分化。细胞脱分化（dedifferentiation）：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。1、诱导期（Induction）脱分化期细胞结构的变化：细胞内合成代谢活跃，细胞质增加显著变浓；大液泡消失；细胞核体积增加并逐渐移位至细胞中央；细胞器增加；细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体，RNA迅速合成和积累。两个重要特征：液泡蛋白体的出现、质体转变为原质体。这一时期细胞形态大小不变。细胞脱分化时间的长短：由一系列内部因素（植物的种类、生理状况）和外部因素（光照、外源激素）决定，烟草24～32h，胡萝卜96h，菊芋22h。细胞脱分化的条件：创伤、外源激素细胞开始分裂，进入分裂期标志着脱分化的完成。分裂方式：第一次分裂的方式通常是有丝分裂；分裂部位：通常在伤口处启动分裂，之后影响到整个外植体细胞进入分裂周期而启动分裂。2、分裂期（Celldivision）细胞通过脱分化的起动期而进入分裂，一般先由外植体的外层细胞开始分裂，中间部分的细胞不分裂形成一个静止的芯，迅速分裂的细胞逐渐回复到分生组织状态，并开始形成愈伤组织。尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果，在大多数情况下是形成愈伤组织，但绝不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。分裂期的主要特征：被启动的细胞进行活跃分裂。细胞体积变小，数目增加，细胞分裂快。细胞分裂形成的分生细胞团形成生长中心，细胞反复增殖，突破外层组织向外生长，形成瘤状的愈伤。结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明。fromleaftissuefromvasculartissueFromrootFromembryoculture分裂期细胞的变化（P40)开始分裂期：外植体外层和组织边缘的细胞开始迅速分裂（平周分裂），细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、有丰富的线粒体和液泡，RNA含量持续上升，类似于根尖或茎尖生长点的细胞。内部的细胞仍然处于静止。分裂高峰期：细胞体积最小，细胞核和核仁最大，RNA含量最高，细胞回复到分生状态。分裂末期：表层细胞的分裂逐渐减少，直至终止，内部较深处细胞开始分裂，分裂面方向改变，形成愈伤组织。（开始进行细胞的再分化）即形成期，是指外植体的细胞经过诱导、分裂形成了无序结构的愈伤组织的时期。但在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列的形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞，出现组织分化。3、分化期（Differentiation）在同一愈伤组织内部，同时存在着处于分裂期与分化期的细胞。分化期的主要特征：出现组织分化。（1）细胞分裂部位和方向发生改变；（2）拟分生组织和维管组织结节的形成；（3）细胞的体积不再减小，出现各种类型的细胞，分生细胞、薄壁细胞、厚壁细胞和管状分子等，出现一定的形态特征；（4）各种酶的活性加强，淀粉的累积，RNA和组蛋白合成速度加快。在生长的愈伤组织中，会出现由小而密集的分裂细胞构成的瘤状结构，分散地分布着，不断分裂，分生中心周缘的细胞分裂停止，成为高度液泡化的薄壁细胞。拟分生组织（meristemoid)拟分生组织（分生组织结节）这些瘤状结构的拟分生组织可以成为愈伤组织的“生长中心”或者进一步分化为“维管组织结节”。经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化和组织分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织才会发生器官再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。离体条件下，细胞再分化是从细胞分化、组织分化、器官分化到形成完整植物体的逐级递进的分化过程。多数情况下发生在愈伤组织中。细胞分化（differentiation）：是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。细胞分化的结果，导致植物体中形成多种类型的细胞。分化是一种持久性的变化，发生在生物体的整个生命过程中。细胞再分化的实质就是细胞分化。（1）细胞分化极性与不均等分裂在细胞再分化中的作用。极性：是指在植物的器官、组织甚至单个细胞中不同轴向上存在的形态结构及生理生化上的差异。极性在低等植物与高等植物中都普遍存在。极性是植物细胞分化中的一个基本现象。细胞的不均等分裂是细胞内极性产生的结果，对细胞分化途径有明显的影响。（2）组织分化TE细胞(trachearyelement)：作为维管系统的主要成分，在维管系统的形成中具有中心作用，是维管发生的一个标志。植物在自然生长条件下，由根和芽的原形成层或次生形成层细胞分化形成。在离体培养条件下，TE细胞由愈伤组织薄壁细胞分化形成，TE细胞的出现标志着组织开始分化。导管分子在离体培养物中较易发生，易于染色和辨认，是离体条件下研究细胞分化的一个模式系统。导管细胞的分化TE细胞的分化可以划分为3个阶段：脱分化脱分化的细胞向TE细胞的转分化转分化是指细胞不经过分裂而直接通过分化转变为另一种类型细胞的过程。TE细胞的特化阶段外植体表面产生的愈伤组织细胞导管分子的分化愈伤组织生长过程中不同类型的管状分子存在方式与活体植株组织中的存在方式相同：幼嫩的环纹式管状分子大都以单独的或少数聚集的方式存在，以适应细胞延长；网纹和孔纹管状分子次生壁坚固，大量成团，出现在生长缓慢的部分。管状分子大多存在于愈伤组织块与培养基相连接的部位，是分生细胞中心与培养基之间的输导通道。在植物的个体发育中，各种组织都是由分生组织（meristematictissue)产生的细胞经过生长和分化而形成的，它们的功能与植物的生长有直接的关系。在离体培养的条件下，拟分生组织（meristemoid)和维管组织(vasculartissue)是联结细胞分化和器官分化的桥梁。在细胞分化的基础上，离体培养物一旦分化出这两种组织，就可能导致器官原基的形成，进一步分化成器官。（3）器官分化在组织分化的基础上会产生器官原基，将分化成不同的器官（不定芽、不定根和花芽等），最终导致完整植株的形成。也称为形态建成。拟分生组织维管组织结节维管组织根原基芽原基不定芽不定根再生植株在培养条件下，植物细胞经过器官分化形成完整个体有两种途径：一是器官发生（organogenesis）二是体细胞胚胎发生（somaticembryogenesis）三、愈伤组织的继代愈伤组织外植体原生质体再生植株悬浮细胞二次诱导愈伤组织悬浮细胞系次生代谢物转基因受体愈伤组织在离体培养体系中的地位1、愈伤组织的类型外观上：旺盛生长的愈伤组织其质地有显著差异，可分为松脆型及坚硬型两类，两者且可以互相转化。再生能力上：胚性愈伤、非胚性愈伤。来源于不同植物或同一植物的不同部位的愈伤在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异。即便是在同一块愈伤上也会由于各种因素的作用存在颜色和结构上的差异。P41由于外植体细胞遗传组成的差异、细胞间互作、营养和水分供应及生长调节物质的刺激等作用，造成愈伤组织块中