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第三章酶第一部分酶通论1.酶的概念2.酶的化学本质及其组成3.酶促反应的特点4.酶的命名和分类5.酶的活力测定和分离纯化6.核酶一、酶的概念酶是一类由活细胞产生的,对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质或RNA,又称为生物催化剂P132(biocatalysts)。酶催化的生物化学反应,称为酶促反应(Enzymaticreaction)。在酶的催化下发生化学变化的物质,称为底物(substrate)。酶学研究简史公元前两千多年,我国已有酿酒记载。一百余年前,Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。1877年,Kuhne首次提出Enzyme一词。1897年,Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液,实现了发酵。1926年,Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。1982年,Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性,提出核酶(ribozyme)的概念。1995年,JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段,称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。二、酶的化学本质及其组成P1371、蛋白质2、核酸酶的分子组成P137单纯酶(simpleenzyme):简单蛋白质结合酶(conjugatedenzyme):缀合蛋白质辅助因子分类(按其与酶蛋白结合的紧密程度)蛋白质部分:酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)辅酶/辅基的作用特点辅酶在催化反应过程中,直接参加了反应。每一种辅酶都具有特殊的功能,可以特定地催化某一类型的反应。在反应中起运载体的作用,传递电子、质子或其它基团。同一种辅酶可以和多种不同的酶蛋白结合形成不同的全酶。一般来说,全酶中的辅酶决定了酶所催化的类型(反应专一性),而酶蛋白则决定了所催化的底物类型(底物专一性)。酶分子中的金属离子根据金属离子与酶蛋白结合程度,可分为两类:金属酶和金属激活酶。金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密,提取过程中不易丢失。金属激活酶(metal-activatedenzyme)金属离子为酶的活性所必需,但与酶的结合不甚紧密。金属离子的作用稳定酶的构象;参与催化反应,传递电子;在酶与底物间起桥梁作用;中和阴离子,降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物的作用传运载体:传递电子、质子或其它基团。小分子有机化合物在催化中的作用根据酶蛋白分子的特点,可将酶分为三类:P138单体酶(monomericenzyme):由单条肽链构成,仅具有三级结构的酶。寡聚酶(oligomericenzyme):由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。多酶体系(multienzymesystem):由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。三、酶促反应的特点酶与一般催化剂的共同点P132辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松,可用透析或超滤的方法除去。辅基(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密,不能用透析或超滤的方法除去。只能催化热力学允许的化学反应;可以缩短化学反应到达平衡的时间,而不能改变反应的平衡常数;酶本身在反应后不发生变化;通过降低活化能加快化学反应速度。酶作为生物催化剂的特点P136(一)酶易失活酶是由细胞产生的生物大分子,凡能使生物大分子变性的因素,如高温、强碱、重金属盐等都能使酶失去催化活性,因此酶所催化的反应往往都是在比较温和的常温、常压和接近中性酸碱条件下进行。酶作为生物催化剂的特点(二)酶促反应具有高效性酶的催化效率通常比非催化反应高108~1020倍,比一般催化剂高107~1013倍。酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activationenergy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。酶作为生物催化剂的特点活化能:底物分子从初态转变到活化态所需的能量酶作为生物催化剂的特点(三)酶促反应具有高度的特异性酶的专一性(specificity)一种酶仅作用于一种或一类化合物,或一定的化学键,催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的专一性或特异性。分类:绝对专一性(absolutespecificity):只作用于一种底物,而不作用于任何其他物质。相对专一性(relativespecificity):这类酶对底物要求低于绝对专一性,可作用于一类结构相近的底物。立体异构专一性(stereospecificity):当底物具有立体异构体时,酶只能作用其中的一种。旋光异构专一性几何异构专一性(四)酶促反应的可调节性酶促反应受多种因素的调控,以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要。酶活力调节:别构效应酶量调节四、酶的分类与命名P139习惯命名方法P139(1)根据作用底物来命名,如淀粉酶、蛋白酶等。(2)根据所催化的反应的类型命名,如脱氢酶、转移酶等。(3)两个原则结合起来命名,如丙酮酸脱羧酶等。(4)根据酶的来源或其它特点来命名,如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。国际系统命名法系统名称包括底物名称、构型、反应性质,最后加一个酶字。例如:习惯名称:谷丙转氨酶系统名称:丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应:丙氨酸+-酮戊二酸谷氨酸+丙酮酸国际系统分类法及酶的编号根据酶所催化的反应类型,按照国际酶学委员会,将酶分为六大类:酶的分类1.氧化还原酶类(oxidoreductases)2.转移酶类(transferases)3.水解酶类(hydrolases)4.裂解酶类(lyases)5.异构酶类(isomerases)6.合成酶类(ligases,synthetases)每个酶都有一个有四个数字组成的编码系统命名法:EC:1.4.1.3EC----enzymecommission1.----类(氧化还原酶类)4.----亚类1.----亚-亚类3.----亚-亚类中的排序五、酶活性测定P142酶活性/酶活力是指酶催化化学反应的能力,其衡量的标准是酶促反应速度。酶促反应速度可在适宜的反应条件下,用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。酶的活性单位是衡量酶活力大小的尺度,它反映在规定条件下,酶促反应在单位时间(s、min或h)内生成一定量(mg、μg、μmol等)的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。国际单位(IU)在特定的条件下,每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。催量单位(katal)1催量(kat)是指在最适条件下,每秒钟使1mol底物转化为产物所需的酶量。kat与IU的换算:1IU=16.67×10-9kat1Kat=6107IU比活力(比活性):每单位(一般是mg)蛋白质中的酶活力单位数(酶单位/mg蛋白)。实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示(如:酶单位/mL(液体制剂),酶单位/g(固体制剂));对同一种酶来讲,比活力愈高则表示酶的纯度越高(含杂质越少),所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标。六、核酶第二部分酶促反应动力学.底物浓度对酶反应速率的影响2.酶的抑制作用3.温度对酶反应的影响4.pH对酶反应的影响5.激活剂对酶反应的影响概念研究各种因素对酶促反应速度的影响,并加以定量的阐述。影响因素包括有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。研究一种因素的影响时,其余各因素均恒定。一、底物浓度对反应速度的影响I.单底物、单产物反应I.酶促反应速度:一般在规定的反应条件下,用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示III.反应速度取其初速度,即底物的消耗量很小(一般在5﹪以内)时的反应速度IV.底物浓度远远大于酶浓度在其他因素不变的情况下,底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。(一)米-曼氏方程式酶促反应模式——中间产物学说1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式,即米-曼氏方程式,简称米氏方程式(Michaelisequation)[S]:底物浓度V:不同[S]时的反应速度Vmax:最大反应速度(maximumvelocity)E+Sk1k2k3ESE+PVVmax[S]Km+[S]=──Km:米氏常数(Michaelisconstant)米-曼氏方程解释:当[S]Km时,v=(Vmax/Km)[S],即v与[S]成正比当[S]Km时,vVmax,即[S]而v不变米氏常数Km的意义(1).物理意义:Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。(2).Km可以反映酶与底物亲和力的大小,即Km值越小,则酶与底物的亲和力越大;反之,则越小。(3).Km值是酶的特征性常数,在一定条件下(如底物、温度、pH、有无抑制剂等),某种酶的Km值是恒定的,因而可以通过测定不同酶的Km值,来判断是否为不同的酶。(4)、Km可用来判断酶的最适底物:当酶有几种不同的底物存在时,Km值最小者,为该酶的最适底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L),两者相比,蔗糖为该酶的天然底物。(5)、Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度:当[S]=10Km时,V=91%Vmax,为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。(6)、Km和Vmax的测定:主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Hanes作图法。Km与Vm的测定1.双倒数作图法(doublereciprocalplot),又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法二、酶浓度对反应速度的影响当[S]>>[E],酶可被底物饱和的情况下,反应速度与酶浓度成正比。关系式为:V=K3[E]三、温度对反应速度的影响双重影响温度升高,酶促反应速度升高;温度升高10oC,反应速度增加一倍由于酶的本质是蛋白质,温度升高,可引起酶的变性,从而反应速度降低。最适温度(optimumtemperature):酶促反应速度最快时的环境温度。温血动物:35~40℃TaqDNA聚合酶:70~75℃可耐受100℃高温此酶是从水生栖热菌ThermusAquaticus(Taq)中分离出的热稳定性DNA聚合酶,用于PCR反应。低温的作用:贮存生物制品、菌种等低温时由于活化分子数目减少,反应速度降低,但温度升高后,酶活性又可恢复。临床上的低温麻醉减少组织细胞的代谢程度,使机体耐受手术时氧和营养物质的缺乏四、pH对反应速度的影响解离状态:蛋白质的极性基团辅助因子的电荷状态底物的解离状态而不同的解离状态或直接影响酶与底物的结合,或影响酶的空间结构,从而改变酶的活力最适pH(optimumpH):酶催化活性最大时的环境pH。•多数酶:7.0左右胃蛋白酶:1.8肝精氨酸酶:9.8五、抑制剂对反应速度的影响酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。区别于酶的变性抑制剂对酶有一定选择性引起变性的因素对酶没有选择性抑制作用的类型不可逆性抑制(irreversibleinhibition)可逆性抑制(reversibleinhibition):竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveinhibition)反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)(一)不可逆性抑制作用概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合,使酶失活。不能用一般的物理方法解除抑制(二)可逆性抑制作用概念抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合,使酶的活性降低或丧失;抑制剂可用透析、超滤等方法除去。类型•竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制1.竞争性抑制作用定义抑制剂与底物的结构相似,能与底物竞争酶的活性中心,从而阻碍酶底物复合物的形成,使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。特点⑴竞争性I往往是酶的底物结构类似物;⑵抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相
本文标题:第六章+酶
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