第六章抗体酶(提纲)2013

第七章抗体酶一、抗体酶的概念抗体由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。抗体的最显著的特征是·多样性和专一性酶是生物催化剂酶是一类具有催化功能的生物分子酶反应有两个主要的特征：高催化效率、高选择性1946年，Pauling用过渡态理论阐明酶催化的实质酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。过渡态理论·····过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。对任何化学反应，反应物在变为产物之前，必须获得一定的能量，成为活化态或称过渡态。过渡态处于最高能阶上。过渡态与反应物的能阶之差称为活化能。获得活化能的多少与反应的速度成正比。过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应所需的活化能。与反应过渡状态结合作用在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状态酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力二、抗体酶的发展抗体酶设想：1969——奇思妙想1抗体和酶有两个共性：蛋白质；专一性酶的过渡态理论1975——东风破·1975年，Kohler和Milstein发明了具有历史意义的单克隆技术，使抗体酶的生产成为可能。1986——梦想照进现实1986年，Schultz和同事在研究中首次观察到抗体具有选择性的催化活性,并将其命名为催化抗体（catalyticantibody）与此同时，Lerner小组也发现了这个现象同年，美国《Science》杂志同时发表了他们的发现，并将这类具有催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶（abzyme）1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。1991——一切皆有可能随后，Schultz实验室对抗体酶进行了深入的研究至1991年，发现的抗体酶可以成功催化所有6种酶促反应和数十种类型的常规反应20世纪90年代起，抗体酶已经开始应用于传统酶无法实现的活体反应和某些传统化学反应三、抗体酶的特点抗体酶具有典型的酶反应特性与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性。具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快102~106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度。抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。抗体酶的特性一种对酶促反应过渡态特异的抗体结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。1、能催化一些天然酶不能催化的反应有许多化学反应还没有已知酶催化进行抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性抗体酶可以根据需要人工裁制从原理上讲，只要能找到合适的过渡态类似物，几乎可以为任何化学反应提供全新的蛋白质催化剂。——Schultz抗体酶的催化反应类型21、转酰基反应2、水解反应3、Claisen重排反应4、酰胺合成反应5、Diels-Alder反应6、转酯反应7、光诱导反应8、氧化还原反应9、脱羧反应10、顺反异构化反应2、有更强的专一性和稳定性抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子抗体酶催化反应的介质效应酯解反应中介质效应：抗体酶在有机溶剂中具稳定性。脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。酰基转移反应中介质效应：在疏水溶剂中，活性较高。四、抗体酶的制备方法（一）诱导法设计半抗原选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物用设计好的半抗原，与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原；将此抗原进行免疫，使宿主针对抗原产生抗体。产生抗体的脾脏细胞与骨髓瘤细胞相融合，得到的杂交瘤细胞既能产生抗体又能在体外培养；将杂交瘤细胞克隆化，即能产生单一均匀的抗体。动物免疫技术和杂交瘤技术有机结合而产生的一种新方法。利用这种方法所得到的抗体酶催化效果的好坏很大程度上取决于化学模型物的设计。反应过渡态类似物，即半抗原的设计。抗体酶用于有机酯的水解，过渡态类似物磷酸盐和磷酸酯作为免疫原诱导产生的单克隆抗体催化水解反应比未催化反应快104倍。（二）拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。（三）引入法用基因工程、蛋白质工程方法改造和制备全新的抗体酶是一种很有前途和发展潜力的抗体酶制备方法。3将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，也可以针对性地改变抗体结合区的某些氨基酸序列，以制备高效的抗体酶。引入功能基团的方法利用部位选择性试剂，用类似亲和标记的方法定向地将催化基团引入抗体。用DNA重组技术和蛋白质工程技术改变抗体的亲和性和专一性，引入酸、碱催化基团或亲核体（四）抗体与半抗原互补法抗体常含有与配体功能互补的特殊功能基。带正电的配体常能诱导出结合部位带负电残基的配体，反之亦然。抗体与半抗原之间的电荷互补对抗体所具有的高亲和力以及选择性识别能力起着关键作用。（五）熵阱法利用抗体结合能克服反应熵垒。抗体结合能被用来冻结转动和翻转自由度，这种自由度的限制是形成活化复合物所必须的。（六）多底物类似物法很多酶的催化作用要有辅因子参与，这些辅因子包括金属离子、血红素、硫胺素、黄素和吡哆醛等。开发将辅因子引入到抗体结合部位的方法无疑会扩大抗体催化作用的范围。用多底物类似物一次免疫动物，可产生既有辅因子结合部位，又有底物结合部位的抗体。（七）抗体库法用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片断，从中筛选特异性的可变区基因。技术基础用一组引物克隆出全套免疫球蛋白的可变区基因从大肠杆菌分泌有结合功能的抗体分子片断方法优越性省去了细胞融合步骤扩大了筛选容量，可筛选106以上个克隆可直接克隆到抗体的基因得到的抗体可以在原核系统表达，降低了制备成本可产生体内不存在的轻重链配对，有可能得到新的特异性抗体五、抗体酶的应用（一）抗体酶在有机合成中的应用可以用抗体酶催化需要精确底物专一性和立体专一性的反应，特别是天然酶不能催化的反应，如对映体专一的脂肪酶已能拆分外消旋醇混合物可以反相胶束和固定化的形式在有机溶剂中起作用具有酯解活力的抗体酶已用于生物传感器的制造（二）抗体酶用于阐明化学反应机制4利用抗体酶可以验证假设的反应机制按照假设的反应机制设计半抗原，并以此产生抗体酶，看其能否催化该反应以验证反应机制的正确性。抗体酶有利于研究生物催化反应过程中的过渡态、极性效应、一般的酸碱催化和亲核催化等机理，从而对于理解自然界酶功能的演变历程具有重要的理论意义，为酶学、免疫学、化学和医学的有机结合搭建了一个成功桥梁。——抗体酶的意义（三）抗体酶在医疗上的应用抗体酶既能标记抗原靶目标，又能执行一定的催化功能。这两种性质的结合使抗体酶在体内的应用实际上是没有限制的。例如，可以设计抗体酶杀死特殊的病原体，也可用抗体活化处于靶部位的药物前体，以降低药物毒性，增加其在体内的稳定性。帮助戒毒（1993年兴起）抗体介导前药治疗技术ADEPT（1991年兴起）将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的抗体酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞表面。前药(prodrug)：由具有生物活性的药物经化学修饰后转变为体外无活性的化合物。这种化合物在体内经酶或非酶作用，脱去保护基，释放出母体药物而发挥治疗作用。前药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性。本章小结掌握抗体及抗体酶的基本概念掌握抗体酶的特性及其与天然酶的区别了解抗体酶的基本制备方法，掌握诱导法制备抗体酶的基本原理和步骤了解抗体酶的应用前景思考题抗体和酶有何异同？什么是抗体酶？与天然酶相比，抗体酶有何特性？抗体酶的制备方法主要有哪些?试述一种制备方法的基本原理和步骤。5