第六章蔬菜露地土壤氨氧化细菌1

第六章蔬菜露地土壤氨氧化细菌(Ammonia-OxidizingBacteria)多样性分析6.1材料(同5.1)6.2土壤微生物总DNA的提取和纯化（同第二章方法二）6.3土壤氨氧化细菌的amoA基因PCR扩增反应，克隆和测序分析PCR扩增所用引物：引物1（amoA-1F）：5’-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3’引物2（amoA-2R）：5’-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3’具体的步骤及方法为：（1）DNA模板预处理通过预试验证明当DNA模板稀释成50-100倍时，所得到的PCR扩增结果最理想。因此将纯化处理的DNA稀释成50倍和100倍进行PCR扩增反应。（2）每管PCR体系：50μl体系Buffer10×5.0μlDNTP(10mM)1.0μl引物1(10PM)0.5μl引物2(10PM)0.5μlTaqase(5U)0.5μlDNA模板5μl（100倍）合计12.5μl（3）每管加ddH2Oμl37.5μl离心A.加石蜡油：10μl；B.设置阳性对照，阴性对照，重复3次；（4）PCR：采用降落PCR的运行程序95℃5min；94℃45s60℃1min35cycles72℃1min72℃15min；4℃10h（5）检测：1.0％琼脂糖电泳（6）将片段的回收：A.将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中，称取重量。B.向胶块中加入3倍体积的溶胶液，55℃水浴10min，其间不断的上下翻转离心管，以确保胶块充分的溶解。C.将上一步所得到的溶液加入到一个新的吸附柱中，13,000rpm离心30s，倒掉废液。将离心柱放回到收集管中。D.向吸附柱中加入700µl漂洗液，13,000rpm离心30s,倒掉废液。将离心柱放回到收集管中。E.向吸附柱中加入500µl漂洗液，13,000rpm离心30s,倒掉废液。将离心柱放回到收集管中。13,000rpm离心2min，尽量去除漂洗液。将吸附柱放置于室温或是50℃温箱数分钟，彻底的凉干。F.将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液30-50µl（洗脱液65-70℃预热），室温放置2min。13,000rpm离心1min收集DNA溶液。取5µl用于连接，其余-20℃保存。（7）与pGEM-T载体连接，16℃连接过夜。10μl体系如下：pGEM-T1μlT4DNA连接酶（4U/µl）1μlBuffer2×5μlPCR产物3μl合计10μl（8）转化：A.将连接产物加入到TOP10高效感受态细胞中，感受态细胞（100μl）置于冰上熔化用冷却的无菌吸头将上述细胞悬浮液分装到新的预冷的离心管，50μl／管加入连接反应液5.0μl，轻轻旋转一混匀内容物，冰浴中放置30min，每隔10min轻轻旋转一下；B.将管放置在42℃水浴中放置60-90s，不要摇动快速的将管转移到冰浴中，使细胞冷却2－3min每管化500μlLB培养基，置于37℃摇床振荡培养，温浴45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素标记基因；C.取100μl的已经转化的感受态细胞转移到含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，用一无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养16h，筛选阳性克隆（白色），用于摇菌和菌落PCR扩增鉴定。（9）按下面组分加入到离心管中，根据载体引物进行PCR检测：T7:5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′SP6:5′-ACGATTTAGGTGACACTATAG-3′超纯水8µl菌液1µlT7(10µmol/L)0.5µlSP6(10µmol/L)0.5µl2×TaqPCRMasterMix10µl总体积20µl按照下面步骤进行PCR循环：95℃2min；95℃30s；57℃30s；（30cycles）72℃1.5min72℃10min，（10）质粒提取进行EcolRI酶切检测EcolRI酶切反应体系：超纯水13µl质粒5µlHbuffer1µlEcolRI1µl总体积20µl(11)经PCR和质粒酶切检测的阳性克隆进行测序分析：该工作交由北京诺塞基因公司完成。6.4丰富度分析，系统发育分析和统计分析利用Sequencherv.4.2(GeneCodes,AnnArbor,MI)对序列进行核酸序列的编辑。对于细菌amoA基因的系统发育分析利用该基因长约491bp大小的片段进行分析。利用MacClade()对该基因的核酸和氨基酸序列进行排列。通过GenBank进行BLAST比对()。序列不一致的程度小于或等于5%时作为一个序列组，被定义为一个可操作分类单元（OTUs）。所有的丰富度分析——包括稀缺性曲线的分析（18）和Chao1nonparametricrichnessestimations（5）都利用DOTUR程序进行分析。Neighbor-joining方法构建系统发育树和parsimonytrees的建立都基于DNA序列比对分析利用ARB来进行()（25）。我们选择核酸序列而不是已知的氨基酸序列在基因点或时间点上来突出遗传的异质部分。利用PYLYP进行Distance-basedandparsimony-basedbootstrapanalyses，并且对古菌的amoA基因进行1,000replicates来评估系统发育分析的可靠性。通过∫-Libshuff(41)程序对两文库群落组成的不同进行比较分析，10000次随机选择并且在PYLYP距离矩阵中利用0.01的距离间隔（D）。利用∫-Libshuff来比较分析本试验中得到的保护地土壤样品和露地土壤样品氨氧化古菌群落多样性的不同。P值利用Dunn-Sida´k方法进行多重比较分析计算得到（44），Pcorrected=1-(1-Puncorrected)1/k，k值表示比较分析的文库数量（对于10个amoA基因文库，每一个文库相应的于其他9个其他文库进行比较，k=10×9=90）。6.5结果与分析6.5.1直接提取土壤微生物的DNA（方法二）保护地根结线虫发生地和露地健康土壤微生物总DNA的提取，均采用土壤微生物总DNA的提取方法二。由土壤微生物总DNA的电泳图谱图1可以看到泳道1，2，3，4为保护地土壤微生物总DNA的提取结果。5，6，7，8为露地土壤微生物总DNA的提取结果。两地土壤分别用两种不同方法提取DNA，3，4，7，8土壤样品均采用预处理方法提取，1，2，5，6土壤样品均未采用预处理方法提取。试验结果表明采用预处理的方法较比不用此方法得到的DNA纯净的多，且得到的DNA的量明显比未采用此方法的要多。原因是对土样进行预处理可以很好地去除这些杂质,减少胞外游离DNA污染,减少可溶性的无机物,有机物的污染,特别是减少腐植酸类物质的污染。而预处理的缓冲液中含有PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）它可以有效去除部分腐植酸类物质。而且EDTA可以络合金属离子，有效抑制核酸酶的活性，防止在下一步的DNA提取过程中造成DNA的降解。M1234567Kb23图2土壤微生物总DNA的提取Fig.1.DNAextractedresultsfromsoilM：λHindIIIDNAMarker1,2,3,4:DNAextractedresultsfromprotectedLand.5,6,7:DNAextractedresultsfromopenground.5.5.2PCR扩增氨氧化细菌amoA基因利用Arch-amoAF和Arch-amoAR对氨氧化古菌amoA基因进行扩增得到大小约为491bp的条带。5.5.3土壤氨氧化古菌的amoA基因克隆文库的构建和测序分析保护地土壤氨氧化古菌amoA基因克隆文库的构建：PCR产物经纯化后连接在PGEM-T载体上转化进入大肠杆菌细胞，取100μl的已经转化的感受态细胞转移到含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养16h，培养基上得到的即为amoA基因克隆文库。通过载体引物PCR扩增筛选阳性克隆（白色），得到的结果如图3。bp700500M1234567891011121314图4阳性克隆PCR检测Fig.4selectivepositiveclonebyPCRM:DNAMarkerIII.1-14:positiveclone